目的使用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)敲除人類宮頸癌細(xì)胞HeLa中的細(xì)胞分裂周期蛋白25同源蛋白C（cell division cycle 25 homolog C,Cdc25C）基因,構(gòu)建Cdc25C基因穩(wěn)定敲除細(xì)胞株。方法根據(jù)CRISPR/Cas9靶點(diǎn)設(shè)計規(guī)則,設(shè)計特異性識別Cdc25C基因第一外顯子相關(guān)序列的上下游小向?qū)NA（small guide RNA,sgRNA）,構(gòu)建真核重組表達(dá)質(zhì)粒。測序鑒定后,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HeLa細(xì)胞中,用嘌呤霉素（puromycin）抗性篩選穩(wěn)定敲除Cdc25C基因細(xì)胞株,再用免疫印跡方法鑒定細(xì)胞Cdc25C敲除效果。最后用流式細(xì)胞儀檢測基因敲除對細(xì)胞周期的影響。結(jié)果篩選出穩(wěn)定敲除Cdc25C基因細(xì)胞株,且Cdc25C敲除顯著影響G2/M期進(jìn)程。結(jié)論利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功獲得了內(nèi)源Cdc25C基因敲除細(xì)胞株,為研究Cdc25C在細(xì)胞周期進(jìn)程的功能以及相關(guān)癌癥的發(fā)生奠定了基礎(chǔ)。 

【文章來源】：軍事醫(yī)學(xué). 2017,41(05)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：4 頁

【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 材料
    1.2 方法
        1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
        1.2.2 sgRNA的設(shè)計
        1.2.3 重組真核表達(dá)質(zhì)粒p Sp Cas9-Cdc25C的構(gòu)建
        1.2.4 Cdc25C基因敲除穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選
        1.2.5 提取細(xì)胞基因組DNA并對目標(biāo)片段進(jìn)行測序
        1.2.6 穩(wěn)定細(xì)胞株的免疫印跡檢測
        1.2.7 細(xì)胞周期的檢測
2 結(jié)果
    2.1 重組表達(dá)載體p Sp Cas9-Cdc25C的構(gòu)建與鑒定
    2.2 免疫印跡篩選Cdc25C基因敲除細(xì)胞株克隆
    2.3 測序驗證Cdc25C的敲除效果
    2.4 Cdc25C基因敲除細(xì)胞株穩(wěn)定性的檢測
    2.5 Cdc25C基因敲除細(xì)胞株的周期進(jìn)程檢測
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