成纖維細(xì)胞生長因子（FGFs）對(duì)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡起重要的調(diào)控作用,并廣泛參與組織發(fā)育和再生過程。成纖維生長因子13（FGF13）作為FGFs亞家族成員,近年來被發(fā)現(xiàn)在多種惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào),但是在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）中的作用和分子機(jī)制還有待明確。本文主要探究了FGF13與SHCBP1對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響及其分子調(diào)控機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)FGF13在A549細(xì)胞中有較高的表達(dá)水平,表明FGF13可能參與A549細(xì)胞增殖過程。因此,分別采用CCK-8、平板克隆形成和細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn),下調(diào)FGF13的表達(dá)能夠顯著抑制A549細(xì)胞增殖,而超表達(dá)FGF13后結(jié)果與之相反。同時(shí),下調(diào)FGF13的表達(dá),Ki67蛋白的陽性率也會(huì)明顯降低。這些結(jié)果證實(shí)FGF13與A549細(xì)胞增殖密切相關(guān)。此外,FGF13的干擾導(dǎo)致A549細(xì)胞周期阻滯在G1/S期,相反超表達(dá)FGF13可以促進(jìn)A549細(xì)胞周期G1/S期的轉(zhuǎn)換。通過檢測G1/S期相關(guān)蛋白,發(fā)現(xiàn)FGF13誘導(dǎo)的細(xì)胞周期阻滯與CyclinE、CDK2、P21和P27的表達(dá)有關(guān)。另一方面,FGF13可以通過激活A(yù)KT/gsk3α/gs... 

【文章來源】：陜西理工大學(xué)陜西省

【文章頁數(shù)】：83 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第1章 緒論
    1.1 成纖維生長因子 13（FGF13）
        1.1.1 FGF13基因結(jié)構(gòu)
        1.1.2 FGF13的功能
    1.2 SHC SH2結(jié)構(gòu)域連接蛋白 1（SHCBP1）
        1.2.1 SHCBP1基因結(jié)構(gòu)
        1.2.2 SHCBP1表達(dá)與功能
    1.3 蛋白質(zhì)互作研究進(jìn)展
    1.4 研究目的及意義
第2章 FGF13在A549細(xì)胞中生物學(xué)功能研究
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象
        2.1.2 試劑、耗材
        2.1.3 試劑配制
        2.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器
        2.1.5 實(shí)驗(yàn)抗體
        2.1.6 實(shí)驗(yàn)引物
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 轉(zhuǎn)錄水平檢測FGF13表達(dá)
        2.2.2 蛋白水平檢測FGF13的表達(dá)
        2.2.3 CCK-8 檢測A549細(xì)胞增殖能力
        2.2.4 平板克隆形成檢測A549細(xì)胞集落成群能力
        2.2.5 細(xì)胞免疫熒光染檢測Ki67蛋白的表達(dá)
        2.2.6 數(shù)據(jù)分析
    2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.3.1 FGF13在A549細(xì)胞中高表達(dá)
        2.3.2 FGF13干擾和超表達(dá)效率檢測
        2.3.3 FGF13高表達(dá)促進(jìn)A549細(xì)胞增殖
        2.3.4 平板克隆檢測A549細(xì)胞集落形成能力
        2.3.5 細(xì)胞免疫熒光檢測Ki67蛋白表達(dá)
    2.4 討論
    2.5 小結(jié)
第3章 FGF13調(diào)控A549細(xì)胞周期并激活A(yù)KT信號(hào)通路
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞
        3.1.2 試劑、耗材
        3.1.3 試劑配制
        3.1.4 實(shí)驗(yàn)抗體
        3.1.5 實(shí)驗(yàn)儀器
        3.1.6 實(shí)驗(yàn)引物
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布
        3.2.2 轉(zhuǎn)錄水平檢測細(xì)胞周期相關(guān)因子表達(dá)
        3.2.3 蛋白水平檢測AKT信號(hào)相關(guān)蛋白表達(dá)
    3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.3.1 FGF13影響A549細(xì)胞周期進(jìn)程
        3.3.2 FGF13影響細(xì)胞周期相關(guān)因子表達(dá)水平
        3.3.3 FGF13激活A(yù)KT信號(hào)通路
    3.4 討論
    3.5 小結(jié)
第4章 FGF13與SHCBP1存在相互作用
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞
        4.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑、耗材
        4.1.3 試劑配制
        4.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器
        4.1.5 實(shí)驗(yàn)引物
        4.1.6 實(shí)驗(yàn)抗體
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 細(xì)胞免疫熒光染色
        4.2.2 FGF13標(biāo)簽載體構(gòu)建及擴(kuò)增
        4.2.3 SHCBP1標(biāo)簽載體構(gòu)建及擴(kuò)增
        4.2.4 蛋白質(zhì)免疫共沉淀（Co-IP）驗(yàn)證FGF13與SHCBP1互作關(guān)系
    4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.3.1 FGF13在A549細(xì)胞中的定位情況
        4.3.2 SHCBP1在A549細(xì)胞中的定位情況
        4.3.3 FGF13和SHCBP1在A549細(xì)胞中存在共定位
        4.3.4 FGF13超表達(dá)標(biāo)簽載體（pcNDA3.1-Flag -FGF13）構(gòu)建
        4.3.5 SHCBP1超表達(dá)標(biāo)簽載體（pcNDA3.1-HA -SHCBP1）構(gòu)建
        4.3.6 FGF13與SHCBP1相互作用的驗(yàn)證
    4.4 討論
    4.5 小結(jié)
第5章 FGF13與SHCBP1互作對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響
    5.1 實(shí)驗(yàn)材料
        5.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞
        5.1.2 試劑、耗材
        5.1.3 試劑配制
        5.1.4 實(shí)驗(yàn)抗體
        5.1.5 實(shí)驗(yàn)儀器
        5.1.6 實(shí)驗(yàn)引物
    5.2 實(shí)驗(yàn)方法
        5.2.1 CCK-8 檢測A549細(xì)胞增殖能力
        5.2.2 細(xì)胞免疫熒光染檢測Ki67蛋白的表達(dá)
        5.2.3 轉(zhuǎn)錄水平檢測SHCBP1的表達(dá)
        5.2.4 蛋白免疫印跡（western blot）
    5.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        5.3.1 SHCBP1超表達(dá)效率檢測
        5.3.2 超表達(dá)SHCBP1對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響
        5.3.3 SHCBP1對(duì)Ki67蛋白表達(dá)的影響
        5.3.4 FGF13與SHCBP1相互作用調(diào)控A549細(xì)胞增殖
        5.3.5 FGF13與SHCBP1相互作用調(diào)控P21、P27和CyclinE1的表達(dá)
        5.3.6 FGF13與SHCBP1共同介導(dǎo)P21、P27和CyclinE1的表達(dá)
    5.4 討論
    5.5 小結(jié)
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄
    附錄Ⅰ 實(shí)驗(yàn)試劑、耗材
    附錄Ⅱ 主要實(shí)驗(yàn)儀器
攻讀碩士學(xué)位期間取得的科研成果
致謝



本文編號(hào)：3148906