Lunasin,是從大豆中分離獲得的新型天然多肽,分子量為5.0 KD左右,含有44個氨基酸;具有多種功能活性,應用前景廣闊。但天然來源的Lunasin多肽含量極低,化學合成成本較高,如何高效獲得Lunasin多肽是需要攻克的難題。隨著分子生物學與基因工程的發(fā)展,利用DNA重組技術高效合成Lunasin多肽使這一設想成為可能。轉(zhuǎn)基因大豆是目前世界上種植范圍最廣泛的遺傳修飾農(nóng)作物,通過基因工程技術獲取優(yōu)良轉(zhuǎn)基因大豆的手段日趨成熟。本研究利用農(nóng)桿菌介導的大豆遺傳轉(zhuǎn)化,將大豆內(nèi)源基因Lunasin多肽編碼基因轉(zhuǎn)入其基因組中,由35S強啟動子啟動基因過量表達,篩選高Lunasin含量的轉(zhuǎn)基因大豆株系,建立轉(zhuǎn)基因大豆功能活性評價體系,結(jié)合轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組學分析揭示Lunasin多肽抗癌分子機制。取得以下實驗進展:1.轉(zhuǎn)基因大豆的獲得:采用農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化將Lunasin多肽編碼基因轉(zhuǎn)入大豆基因組中,目前已獲得15個獨立的T1代轉(zhuǎn)基因大豆株系。建立了Lunasin多肽高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用分析方法,Lunasin多肽在保留時間10.606 min時出峰,其一級質(zhì)譜分析可檢測到多個母離子信號,... 

【文章來源】：中國農(nóng)業(yè)科學院北京市

【文章頁數(shù)】：89 頁

【學位級別】：博士

【部分圖文】：

Lunasin多肽的一級結(jié)構(gòu)序列及功能示意圖(Hernándezledesmaetal.,2009)

中國農(nóng)業(yè)科學院博士學位論文第一章引言10化能力；選用脂多糖LPS誘發(fā)的小鼠巨噬細胞RAW26.7炎癥反應為試驗模型，檢測Lunasin多肽富集物對炎癥反應的抑制能力。人乳腺癌細胞MDA-MB-231是廣泛應用于癌癥機理研究、靶標信號傳導和功能營養(yǎng)等方面的一類細胞株，因此可通過分析Lunasin多肽富集物對MDA-MB-231細胞增值的抑制情況來評估其抗癌活性。通過細胞免疫熒光染色對Lunasin多肽進行亞細胞定位分析，了解Lunasin多肽在哺乳動物細胞內(nèi)發(fā)揮功能時的具體部位。3.選用人乳腺癌細胞MDA-MB-231模型，綜合應用轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組測序技術，全面分析Lunasin處理前后細胞內(nèi)基因表達調(diào)控，分析蛋白間的相互作用，篩選差異基因、差異蛋白，進行GO/KEGG富集分析，挖掘其抗癌核心調(diào)控網(wǎng)絡。1.8.2技術路線圖1-2實驗技術路線示意圖Fig.1-2Schematicdiagramofexperimentaltechnicalroute

中國農(nóng)業(yè)科學院博士學位論文第二章Lunasin過表達轉(zhuǎn)基因大豆的獲得及其分子生物學分析1680%B，23min80%B，24min5%B，30min5%B。質(zhì)譜型號為飛行時間質(zhì)譜（TripleTOF6600），離子源為電噴霧離子源（ESI源），采用IDA模式對樣品進行檢測，樣品經(jīng)離子化后進行TOF-MS一級掃描（掃描范圍為200-2000Da）和TOF-MS/MS子離子掃描（掃描范圍為50-2000Da）。離子源溫度為550℃，霧化氣Gas1為50psi，以氮氣作為輔助加熱氣Gas2（50psi），氣簾氣為35psi，離子采集模式為正離子模式。2.3結(jié)果與分析2.3.1轉(zhuǎn)基因大豆的獲得通過對大豆愈傷組織的抗性篩選及PCR鑒定，我們獲得了15個獨立的轉(zhuǎn)基因大豆株系。如圖2-1所示為大豆遺傳轉(zhuǎn)化載體構(gòu)建示意圖，Lunasin編碼基因由35S強啟動子啟動表達；另外，在農(nóng)桿菌T-DNA區(qū)域含有草甘膦抗性篩選（EPSPS），由Tsf啟動子控制表達，便于轉(zhuǎn)基因材料的初步確定。圖2-2所示為大豆遺傳轉(zhuǎn)化詳細過程：(a)挑選顆粒飽滿的大豆種子進行萌發(fā)試驗；(b)農(nóng)桿菌侵染；(c)農(nóng)桿菌與下胚軸共培養(yǎng)；(d)愈傷組織的抗性篩眩(e)胚性抗性愈傷誘導過程，誘導其分化，生根、發(fā)芽。(f)植株再生，獲得轉(zhuǎn)基因大豆。圖2-1載體構(gòu)建示意圖Fig.2-1Vectorconstruction圖2-2大豆遺傳轉(zhuǎn)化Fig.2-2Genetictransformationofsoybean圖2-2（a）大豆萌發(fā)，獲取大豆下胚軸；2-2（b）農(nóng)桿菌侵染外植體；（c）農(nóng)桿菌與下胚軸共培養(yǎng)；（d）愈傷組織抗性篩選；（e）胚性抗性愈傷誘導分化；（f）植株再生。2-2(a)Soybeanseedswereselectedtogerminatefortheexplants.(b)Agrobacteriuminfection.(c)Co-cultureofexplantsandagrobacteria.(d)Resistancescreeningofcallus.(e)Inductiondifferentiationofthecallus.(f)Plantletregeneration.

【參考文獻】：
期刊論文
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本文編號：3121555