成熟水稻種子胚乳中的淀粉含量約占種子干重的80%,因而稻米食味品質(zhì)受淀粉品質(zhì)直接影響。淀粉由支鏈淀粉和直鏈淀粉組成,淀粉合成過(guò)程受一些列酶調(diào)控。淀粉合成的底物是ADPG,由ADP-Glc焦磷酸化酶（AGPase）催化合成,起催化作用的部位位于該酶的小亞基AGPS。本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)水稻淀粉合成相關(guān)基因AGPS1進(jìn)行編輯,得到以下結(jié)論:1、本研究中以粳稻品種“嘉花1號(hào)”（JH）為研究對(duì)象,利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功對(duì)AGPase的一個(gè)小亞基基因AGPS1（LOC_Os08g25734）進(jìn)行了編輯,獲得了插入一個(gè)堿基C的編輯植株,也證明了利用CRISPR/Cas9技術(shù)改變水稻淀粉品質(zhì)的可行性。2、T₁代共有4株苗存活,將其命名為k1、k2、k3、k4,單獨(dú)收取其種子,并進(jìn)行自交繁殖后代。k1后代始終保留了轉(zhuǎn)基因載體,k2、k3、k4獲得了剔除轉(zhuǎn)基因載體的突變體。3、分別對(duì)突變體k1和k4的種子中與淀粉合成相關(guān)的11個(gè)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量分析。突變體k1在發(fā)育后期GBSSⅡ、SBE1、SBE3基因的表達(dá)量明顯高于野生型... 

【文章來(lái)源】：上海師范大學(xué)上海市

【文章頁(yè)數(shù)】：54 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

單靶點(diǎn)U6a-T-gRNA表達(dá)盒構(gòu)建和擴(kuò)增模式圖

上海師范大學(xué)碩士學(xué)位論文材料與方法13③回收純化U6a-T-gRNA表達(dá)盒對(duì)U6a-T-gRNA表達(dá)盒的克隆產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，對(duì)約600bp位置的電泳條帶進(jìn)行切膠回收純化（本實(shí)驗(yàn)?zāi)z回收均使用康為世紀(jì)公司的膠回收試劑盒），然后以B1/BL為引物進(jìn)行擴(kuò)增并送公司測(cè)序驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的U6a-T-gRNA表達(dá)盒放置于-20℃保存?zhèn)溆谩＂苓B接MH終載同樣采用邊切邊連的方法將gRNA表達(dá)盒連入MH最終載體。以上一步驗(yàn)證正確的U6a-T-gRNA表達(dá)盒純化產(chǎn)物作為原料，反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如下：U6a-T-gRNA表達(dá)盒連接MH終載模式圖如下：圖2-3單靶點(diǎn)U6a-T-gRNA表達(dá)盒連接MH終載模式圖（3）雙靶點(diǎn)質(zhì)粒載體構(gòu)建構(gòu)建雙靶點(diǎn)載體的過(guò)程也分為構(gòu)建、擴(kuò)增、回收純化gRNA表達(dá)盒以及連接MH終載。構(gòu)建雙靶點(diǎn)gRNA表達(dá)盒時(shí)，分別將第一個(gè)和第二個(gè)靶點(diǎn)接頭引物與U6a質(zhì)粒和U6b質(zhì)粒連接構(gòu)成U6a-T-gRNA表達(dá)盒和U6b-T-gRNA表達(dá)盒。反應(yīng)體MH質(zhì)粒2μlU6a-T-gRNA4μlBsaⅠ1μlBsaⅠbuffer1μlT4連接酶1μlT4buffer3μlddH2O3μl總體積15μl37℃，2min10℃，3min20℃，5min37℃，2min16℃保存反應(yīng)條件15個(gè)循環(huán)

上海師范大學(xué)碩士學(xué)位論文材料與方法15構(gòu)建并擴(kuò)增U6a-T-gRNA與U6b-T-gRNA表達(dá)盒的模式圖如下：圖2-4雙靶點(diǎn)U6a-T-gRNA與U6b-T-gRNA表達(dá)盒構(gòu)建和擴(kuò)增模式圖對(duì)第二輪克隆產(chǎn)物進(jìn)行電泳，帶長(zhǎng)為600bp左右的是U6a-T-gRNA表達(dá)盒，U6b-T-gRNA表達(dá)盒電泳帶長(zhǎng)為500bp左右，分別切膠回收純化。然后分別以引物B1/B2擴(kuò)增U6a-T-gRNA表達(dá)盒純化產(chǎn)物，以引物B2’/BL擴(kuò)增U6b-T-gRNA表達(dá)盒純化產(chǎn)物，并測(cè)序驗(yàn)證。構(gòu)建雙靶點(diǎn)MH終載時(shí)，將測(cè)序驗(yàn)證后的U6a-T-gRNA和U6b-T-gRNA表達(dá)盒混合在一起通過(guò)邊切邊連的方法連接到MH終載質(zhì)粒上。反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如下：U6a-T-gRNA和U6b-T-gRNA表達(dá)盒連接MH終載模式圖如下：MH質(zhì)粒4μlU6a-T-gRNA3μlU6b-T-gRNA3μlBsaⅠ0.5μlBsaⅠbuffer1.5μlT4連接酶0.5μlT4buffer2.5μl總體積15μl37℃，2min10℃，3min20℃，5min37℃，2min16℃保存反應(yīng)條件15個(gè)循環(huán)

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
[1]水稻糊化溫度特性的理化基礎(chǔ)與分子遺傳學(xué)研究[D]. 舒小麗.浙江大學(xué) 2006

碩士論文
[1]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯水稻淀粉合成相關(guān)的SSIIIα與PPDK的定點(diǎn)突變研究[D]. 吳清清.上海師范大學(xué) 2019
[2]普通水稻淀粉結(jié)構(gòu)和功能特性研究[D]. 蔡金文.揚(yáng)州大學(xué) 2015
[3]轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良稻米直鏈淀粉含量的研究[D]. 于恒秀.揚(yáng)州大學(xué) 2002



本文編號(hào)：3118553