禽大腸桿菌病由于其發(fā)病率高,病原菌血清型多樣對(duì)各國(guó)禽類養(yǎng)殖業(yè)產(chǎn)生嚴(yán)重危害。APEC中的PhoP-PhoQ二元調(diào)控系統(tǒng)主要參與調(diào)控細(xì)菌毒力基因的表達(dá)、細(xì)菌對(duì)Mg2+限制性生長(zhǎng)環(huán)境的適應(yīng)過(guò)程、上皮細(xì)胞侵襲和抗菌肽抗感染等過(guò)程,在禽致病性大腸桿菌致病的過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。有研究發(fā)現(xiàn)酸性pH、低Mg2+和抗菌肽能夠促進(jìn)PhoP的磷酸化,激活PhoP蛋白調(diào)控的下游靶基因使細(xì)菌適應(yīng)環(huán)境的改變。因此本研究以AE17、△phoP、△phoQ和△phoPQ缺失株為研究對(duì)象,以Mg2+濃度,酸性pH和禽β防御素（AvBD9）為培養(yǎng)條件檢測(cè)其細(xì)菌的體外生長(zhǎng)情況。通過(guò)制備PhoP兔源多克隆抗體,利用RT-qPCR和Western blot方法檢測(cè)不同pH、Mg2+濃度和AvBD9培養(yǎng)環(huán)境中phoP基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的變化,為進(jìn)一步研究PhoP在APEC中的調(diào)控作用提供理論依據(jù)。主要研究?jī)?nèi)容如下:1.PhoP蛋白表達(dá)條件的優(yōu)化及PhoP多克隆抗體的制備與檢測(cè)本試驗(yàn)通過(guò)優(yōu)化誘導(dǎo)溫度、IPTG誘導(dǎo)濃度、誘導(dǎo)時(shí)間和細(xì)菌濃度等條件,篩選出目的蛋白表達(dá)量最高的優(yōu)化條件。結(jié)果顯示菌液培養(yǎng)至OD600nm為1.0時(shí)加入終... 

【文章來(lái)源】：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)安徽省

【文章頁(yè)數(shù)】：71 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖２－９?ＢＣＡ法測(cè)定蛋白含量??Ｆｉｇ．９?ｐｒｏｔｅｉｎ?ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ?ｗａｓ?ｄｅｔｅｃｔｅｄ?ｂｙ?ＢＣＡ?ｍｅｔｈｏｄｓ??

蛋白樣品???濃度（ｆｉｇ／ｍｌ）?ＯＤ５６２?濃度（ｍｇ／ｍｌ）?ＯＤ５６２??０?０．１１１??２５?０．１１９??７５?０．１３１??１２５?０．１４０??３．６２１?１．０４１??２５０?０．１７４??５００?０．２４３??７５０?０．３０５??１０００?０３６６??２．３禽致病性大腸桿菌ＰｈｏＰ蛋白多克隆抗體的檢測(cè)??２．３．１雙向瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)兔抗ＰｌｉｏＰ血清效價(jià)??２．３．１．１最佳蛋白濃度條件的摸索??雙向瓊脂擴(kuò)散結(jié)果如圖２－丨０，可見(jiàn)在抗原濃度為０．２?ｍｇ／ｍ丨時(shí)，仍呈現(xiàn)明顯沉線，??因此，最佳抗原濃度為０．２?ｍｇ／ｍｌ。??２?？．秦?１??圖２－?１０最佳抗原濃度條件的測(cè)定??Ｆｉｇ．?２－１０?Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｏｐｔｉｍａｌ?ａｎｔｉｇｅｎ?ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ?ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ??卜６：?ｌ?ｍｇ／ｍｌ、０．８?ｍｇ／ｍｌ、０．６?ｍｇ／ｍｌ、０．４?ｍｇ／ｍｌ、０．３?ｍｇ／ｍｌ、０．２?ｍｇ／ｍｌ；?７：免疫血清??ｌ－６：?ｌ?ｍｇ／ｍｌ，?０．８?ｍｇ／ｍｌ，?０．６?ｍｇ／ｍｌ，?０．４?ｍｇ／ｍｌ，?０．３?ｍｇ／ｍｌ，?０．２?ｍｇ／ｍｌ；?７：?ｉｍｍｕｎｅ?ｓｅｒｕｍ??２．３．１．２血清效價(jià)的測(cè)定??雙向瓊脂擴(kuò)散結(jié)果如圖２－丨丨，可見(jiàn)在抗體稀釋度為丨：１６時(shí)，仍呈現(xiàn)明顯沉線，??兔抗ＰｈｏＰ多克隆抗體效價(jià)為１：１６。??２５??

＾＾１??Ｍｇ？８Ｗ??圖２－?１丨雙向瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ＰｈｏＰ多克隆血清效價(jià)??Ｆｉｇ．２－１１?Ｄｏｕｂｌｅ?ａｇａｒ?ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ?ｔｅｓｔ?ｏｆ?ＰｈｏＰ?ａｎｔｉｂｏｄｙ?ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ?ｉｎ?ｒａｂｂｉｔｓ??１：免疫血清原液；２－６：?１：?２、１：?４、１：?８、１：?１６、１：?３２稀釋的免疫血清；７：?ＰｈｏＰ蛋白??１：?ｒａｂｂｉｔ?ｓｅｒｕｍ；?２－６：?ｒａｂｂｉｔ?ｓｅｒｕｍ?ｄｉｌｕｔｅｄ?ｂｙ?１：２，?１：４，?１：８，?１：１６，?１：３２；?７：?ＰｈｏＰ?ｐｒｏｔｅｉｎ??２＿３＿２?ＥＬＩＳＡ法檢測(cè)兔抗ＰｈｏＰ血清效價(jià)??用ＥＬＩＳＡ法檢測(cè)加強(qiáng)免疫后的兔血清抗體效價(jià)，免疫后血清效價(jià)吸光度與免疫??前血清效價(jià)吸光度比值大于２，則判斷為陽(yáng)性。兔子經(jīng)過(guò)４次免疫后，獲得ＰｈｏＰ蛋??白抗血清，經(jīng)ＥＬＩＳＡ法檢測(cè)，其效價(jià)可達(dá)到１：２０９７１５２００，如圖２－１２所示。??５０．０??４５．０?？—???４０．０??§?３５．０?＼??ｇ?３。．。?＼??＾?２５．０?＇??＾?２０－°?＼??窆?１５．０?????１〇＇°?？??Ｊ?———??４００００?１６００００?６４００００?２５６００００?１０２４００００?４０９６００００?１６３８４００００?６５５３６００００??抗體稀釋度??圖２－?１２兔抗ＰｈｏＰ蛋白多克隆抗體效價(jià)曲線??Ｆｉｇ．２－１２?Ｔｈｅ?ｃｕｒｖｅ?ｏｆ?ｒａｂｂｉｔ?ａｎｔｉ－ＰｈｏＰ?ｐｒｏｔｅｉｎ?ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ?ａｎｔｉｂｏｄｙ?ｔｉｔｅｒ??２．３．３兔抗ＰｈｏＰ血清的


本文編號(hào)：3087896