天然免疫是天然免疫系統(tǒng)為自我成分與非自我成分的區(qū)分識(shí)別奠定了免疫應(yīng)答與調(diào)控的基礎(chǔ),干擾素調(diào)節(jié)因子3（Interferon regulatory factor3,IRF3）是干擾素調(diào)節(jié)因子家族的主要成員之一,也是天然免疫信號(hào)通路中重要的干擾素調(diào)節(jié)因子,當(dāng)DNA病毒感染時(shí)可激活STING/TBK1/IRF3天然免疫信號(hào)通路,最終激活Ⅰ型干擾素（Type Ⅰ interferon,IFN）的表達(dá)。本試驗(yàn)使用慢病毒介導(dǎo)的CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建IRF3基因穩(wěn)定敲除豬腎上皮PK15細(xì)胞系。構(gòu)建pIRF3-sgRNA重組質(zhì)粒與慢病毒包裝載體共轉(zhuǎn)染至HEK293T/17細(xì)胞,收獲慢病毒并感染PK15豬腎上皮細(xì)胞,經(jīng)嘌呤霉素篩選獲得多克隆細(xì)胞系,T7酶切鑒定篩選基因編輯效率較高的多克隆細(xì)胞,然后通過有限稀釋法獲得PK15-IRF3-/-單克隆穩(wěn)定細(xì)胞系。為驗(yàn)證IRF3基因穩(wěn)定敲除細(xì)胞系是否構(gòu)建成功,首先使用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)觀察PRV-GFP病毒在感染PK15-WT以及PK1 5-IRF3-/-細(xì)胞后0h、6h、12h、24 h、36h、48 h病毒復(fù)制的差異,其次TCID50檢測(cè)P... 

【文章來源】：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)河南省

【文章頁數(shù)】：47 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖１?ＴＬＫ信號(hào)通路ｌ４ｑｌ??Ｋｉｇ．?Ｉ?ＴＬＲ?ｓｉｇｎａｌｉｎｇ?ｐａｔｈｗａｙ?＇＾１??６??

，？ｋｉｎｅｓ?馨Ｉ：?＾??＇ｔｒ＜？ＳＳ?ＰＫＲ?Ｌ?ｄ＞ＲＮＡ－＾?ｓＫｔｅ?ｐｒｏｄｕｃｔ?ｏｆ?ｖ＾ｌ??＿?ｔｒａｎ＾ｒ．ｐｄＷ＾Ｉ．Ｃ．ｏ?Ｒ＾；??雙微—卞一?＾＾?及．８??ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ?〇?＿??ｏｆ?ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ?二?＇?＇￥＇＇ｍ?Ｅ３ｔ??？?以，／?Ａ?Ａ??Ｓｇ＾Ｘ／ｘ，－ｖｚｘｙｘｙｘ?參?＇?〇４￥＾??！?＇？也??＇?￣￣￣＊＊?１?！?－：二??ＡｎｔｍｒａＫｉｅｎｅｓ?????圖２?ＰＫＲ信號(hào)通路Ｗ丨??Ｆｉｇ．２?ＰＫＲ?ｓｉｇｎａｌｉｎｇ?ｐａｔｈｗａｙ?１４９１??１．４．３．２?ＲＩＧ信號(hào)通路??ＲＬＲ乂稱Ｒ１Ｇ－Ｉ樣受體，ＲＩＧ－Ｉ為ＲＮＡ解旋酶，其羧基端含有解旋酶域，有兩個(gè)半骯天冬??酶募集結(jié)構(gòu)域（ＣＡＲＤ），主要介導(dǎo)蛋白質(zhì)間的相互作用。ＲＩＧ－丨樣受體于ＴＬＲ樣受體相同，??都足通過＋?Ｍ的蛋白質(zhì)間ＣＡＲＤ結(jié)構(gòu)域相互結(jié)合構(gòu)成復(fù)合物。病毒感染細(xì)胞后釋放的ｓｓＲＮＡ??和ｄｓＲＮＡ被ＲＩＧ－丨樣受體識(shí)別，隨后體內(nèi)ＡＴＰ與ＲＩＧ－Ｉ的解旋酶域特異性結(jié)合使ＲｌＧ－丨樣受休??蛋丨勺發(fā)生構(gòu)象改變將隱藏Ｐ內(nèi)部的ＣＡＲＤ蛋白結(jié)構(gòu)域暴露出來。因此ｉｉｊ以通過ＣＡＲＤ結(jié)構(gòu)域??與卜游銜接蛋白ＶＩＳＡ的ＣＡＲＤ結(jié)構(gòu)域結(jié)合并相互作用。ＶＩＳＡ主要定位于線粒體外膜上，口Ｊ＇??利用細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子３?（ＴＲＡＦ３）將Ｒ１Ｇ－Ｉ的激活產(chǎn)生信號(hào)傳遞給下游??的ＴＡＮＫ結(jié)合激酶１?（ＴＢＫ１）與ＩｋＢ激酶（ＩＫＫ），使其所在下游的ＩＲＦ３／７和ＮＦ－ｋＢ的活化以??及ＩＦＮ蓽因的轉(zhuǎn)錄。??１．４．３．３?Ｍｘ?

的ｓｓＲＮＡ切割，從而使病毒起始階段受到影響導(dǎo)致??蛋廣１多肽鏈合成受附，從而能夠抑制病毒蛋白的轉(zhuǎn)錄合成。同時(shí)，ＲＮａｓｅ?Ｌ可切割部分自身??的ｍＲＮＡ也可以形成小ＲＮＡ，這我小的ＲＮＡ激活ＲＩＧ－丨和ＭＤＡ－５等信號(hào)通路，從而誘導(dǎo)丨ＦＮ??生成及抑制病毒復(fù)制＠１。??ｎ?？?ｐ??ＯＭｇｏＡ?丄?Ａｃｔｉｖｅ??＾?ｓｒｒ?？??Ａｃｔｉｖｅ?｜??ＣＳＳＳ?（Ｗ）丄??個(gè)?〉Ｔｒｓｎｖｔｏｔｌｏｎ??ｒ—＞?ＩＲｆ?７?ｌｎｌ？ｒｆ＊ｒｏｎ??＿Ｊ???圖３?ＯＡＳ介導(dǎo)的ＲＮａｓｅ?Ｌ信號(hào)通路ｍ??Ｋｉｇ．３?ＯＡＳ?ｍｅｄｉａｔｅｄ?ＲＮａｓｅ?Ｌ?ｓｉｇｎａｌｉｎｇ?ｐａｔｈｗａｙ?１５５１??１．４．３．５丨ＳＧＩ?５信號(hào)通路??ＩＦＮｉ秀導(dǎo)產(chǎn)Ｕ「多類抗病得ａａ＇ｍ中ＩＳＧ就足較為？耍的類，其中丨ＳＧ１５足丨ＦＮ誘導(dǎo)能??夠的抑制病冉效成較為不＋＿Ｈ要作用的抗病＿蛋閂？雖然在很多年前就Ｗ科學(xué)家克隆出丨ＳＧ１５??描Ｗ，其具Ａ抗病訴效應(yīng)足近年來Ｉ被人們所認(rèn)知，但是其抗病毒機(jī)制尚未研宂清楚。研究??農(nóng)明：ＩＳＧ１５＂］？促進(jìn)病毐介導(dǎo)的丨ＦＮ調(diào)節(jié)因子３激活，從而提高ＩＦＮ－Ｐ的釋放與其抗病毒效果??相反，磷酸＿２（：－０：丨：要利用調(diào)擰轉(zhuǎn)化牛長因子－Ｐ?（ＴＧＦ－｜３）活化和激酶磷酸化，而ＩＳＧ１５??可以和蛋丨１磷酸？２Ｃ－Ｐ結(jié)合特異性競(jìng)爭(zhēng)結(jié)果，達(dá)到后負(fù)向調(diào)控該機(jī)制進(jìn)而增強(qiáng)ＮＦ－ｋＢ信號(hào)傳??導(dǎo)和ＩＦＮ站丨用表達(dá)??８??


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