利用分子生物學(xué)技術(shù)從梭梭中克隆了HabHLH74轉(zhuǎn)錄因子基因,在大腸桿菌中表達(dá)HabHLH74蛋白,旨在為梭梭抗逆分子機(jī)理提供研究基礎(chǔ)。研究結(jié)果表明:①利用RT-PCR技術(shù)成功擴(kuò)增了HabHLH74的完整編碼區(qū)c DNA序列,HabHLH74編碼區(qū)cDNA序列長度為1 218 bp。根據(jù)HabHLH74編碼區(qū)序列預(yù)測出其編碼蛋白的理化性質(zhì)。②成功構(gòu)建了HabHLH74基因的原核表達(dá)載體pET28a（+）-HabHLH74,并在大腸桿菌中成功表達(dá)了梭梭HabHLH74蛋白,其分子量為43.6 kDa。③對誘導(dǎo)條件進(jìn)行單因素試驗后獲得的最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件:誘導(dǎo)劑IPTG濃度為0.5 mmol/L,誘導(dǎo)溫度為37℃,誘導(dǎo)時間為6 h。④對在優(yōu)化條件下誘導(dǎo)后的菌體進(jìn)行超聲破碎后發(fā)現(xiàn)梭梭HabHLH74蛋白主要以包涵體形式存在;降低誘導(dǎo)溫度（16℃、25℃誘導(dǎo)）未能得到可溶性表達(dá)的梭梭HabHLH74蛋白。 

【文章來源】：畜牧與飼料科學(xué). 2020,41(05)

【文章頁數(shù)】：6 頁

【部分圖文】：

重組菌誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE凝膠電泳檢測結(jié)果

2.5.3 誘導(dǎo)時間的優(yōu)化在誘導(dǎo)溫度（37℃）和誘導(dǎo)劑濃度（0.5 mmol/L）恒定不變的前提下，分別對誘導(dǎo)0、2、3、4、5、6、7、8、9 h的表達(dá)樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測，結(jié)果顯示，在加入誘導(dǎo)劑的0～6 h目的蛋白表達(dá)量逐漸升高，6 h以后開始下降（見圖7）。因此，最佳誘導(dǎo)時間為6 h。

對16℃過夜誘導(dǎo)、25℃誘導(dǎo)4 h、42℃誘導(dǎo)4 h的重組菌BL21(DE3)-p ET28a(+)-Hab HLH74菌體超聲破碎后的上清液和沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，分析Hab HLH74蛋白的表達(dá)形式。結(jié)果見圖9，泳道2、3、4分別為16、25、42℃誘導(dǎo)表達(dá)之后上清液中的蛋白，泳道5、6、7為沉淀中的蛋白；結(jié)果顯示，上清液中沒有明顯的目的蛋白條帶，說明Hab HLH74蛋白仍然主要以包涵體形式存在，改變誘導(dǎo)條件不能得到可溶性的目的蛋白。圖7 不同誘導(dǎo)時間誘導(dǎo)表達(dá)的Hab HLH74蛋白的SDS-PAGE凝膠電泳檢測結(jié)果

【參考文獻(xiàn)】：
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本文編號：3041069