目的探討B(tài)MP-2基因修飾的復(fù)層乳牙牙髓干細(xì)胞膜片的體外構(gòu)建方法及基本生物學(xué)特性。方法分離培養(yǎng)脫落乳牙牙髓干細(xì)胞（stem cells from human exfoliated deciduous teeth,SHEDs）,并通過轉(zhuǎn)染BMP-2基因進(jìn)一步提高SHEDs的成骨能力,隨后以SHEDs為種子細(xì)胞構(gòu)建復(fù)層細(xì)胞膜片。利用倒置顯微鏡對細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率及成骨能力進(jìn)行觀察;通過HE染色和Masson染色對細(xì)胞膜片的結(jié)構(gòu)和膠原分布進(jìn)行檢測;以免疫組織化學(xué)染色檢測BMP-2蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果體外分離培養(yǎng)了SHEDs,并證實其具有多向分化潛能。采用富含維生素C的培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)10 d左右即可獲得白色膜樣結(jié)構(gòu),該細(xì)胞膜片具有較好的彈性,疊加兩層單層膜片繼續(xù)培養(yǎng)24 h可構(gòu)建具有良好韌性和機(jī)械性能的復(fù)層膜片。HE染色及Masson染色觀察發(fā)現(xiàn)SHEDs膜片由多層細(xì)胞及豐富的細(xì)胞外基質(zhì)組成。免疫組織化學(xué)染色示SHEDs膜片可表達(dá)BMP-2蛋白。結(jié)論 BMP-2基因修飾的SHEDs體外采用富含維生素C的培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)可構(gòu)建具有良好機(jī)械性能的復(fù)層細(xì)胞膜片并持續(xù)表達(dá)BMP-2蛋白,該膜片將為牙周骨缺損修... 

【文章來源】：哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報. 2020,54(03)

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【部分圖文】：

SHEDs形態(tài)學(xué)觀察及多向分化能力檢測×100

實驗組(BMP-2轉(zhuǎn)染的SHEDs)中綠色熒光蛋白強(qiáng)表達(dá)，轉(zhuǎn)染效率約為23.8%，而在對照組(未經(jīng)BMP-2修飾的SHEDs)中則沒有檢測出熒光信號(圖2)。經(jīng)過成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后，與對照組相比，實驗組顯示出了更高的ALP活性和礦化能力(圖3)。2.3 BMP-2修飾的復(fù)層SHEDs膜片的表征

SHEDs成膜片誘導(dǎo)10 d后，6孔板底部可見一層厚薄較為均勻的白色膜樣物質(zhì)，邊緣微微卷起(圖4A)，用細(xì)胞刮刀沿邊緣輕輕分離，可獲得連續(xù)的完整的細(xì)胞膜片。分離的膜片大小會自行收縮，置于PBS中可伸展開，具有良好的彈性(圖4B)。將1張膜片分離并疊加于另一層膜片上，制備復(fù)層膜片(圖4C)。復(fù)層膜片經(jīng)過24 h的培養(yǎng)，與單層膜片對比，不透光性增大，厚度明顯增加(圖4D)。HE染色觀察到膜片厚度均勻，單層膜片約為3～4層細(xì)胞構(gòu)成(圖5A)，細(xì)胞排列較為松散，復(fù)層膜片約6～8層細(xì)胞構(gòu)成(圖5B)，細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞與細(xì)胞間可見均勻粉染的細(xì)胞外基質(zhì)。Masson染色可見膜片中細(xì)胞外基質(zhì)呈綠色，表明細(xì)胞外有大量膠原分泌(圖5C、D)。BMP-2基因修飾的膜片組的BMP-2蛋白免疫組化染色可見棕黃色顆粒，表明經(jīng)過膜片培養(yǎng)后SHEDs仍然持續(xù)表達(dá)BMP-2蛋白(圖5E、F)。圖4 BMP-2修飾的復(fù)層SHEDs膜片的大體觀察照片

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]細(xì)胞膜片技術(shù)在組織工程中的應(yīng)用與研究進(jìn)展[J]. 周術(shù)奎,張楷樂,王營,傅強(qiáng).  中國組織工程研究. 2016(11)



本文編號：3027506