家蠶是重要的經(jīng)濟昆蟲。家蠶品種的性狀決定蠶絲的產(chǎn)量、品質及后續(xù)產(chǎn)品的附加值增幅。因此,培育優(yōu)良品種一直是蠶業(yè)工作者努力的目標。培育家蠶優(yōu)良品種的傳統(tǒng)方法主要是通過突變篩選獲得期待的性狀,再通過遺傳雜交的方式將目標性狀導入到各個生產(chǎn)品種之中。但是,這種方法受到多種因素的限制而影響育種周期。近年來,隨著基因組測序工作的推進以及基因編輯技術在家蠶上的應用,為定向育種和加快育種進度奠定了良好的基礎。本研究旨在瞄準家蠶產(chǎn)量和質量性狀這兩項重要內容進行研究:第一,利用轉基因和基因編輯技術對家蠶保幼激素（Juvenile hormone,JH）和蛻皮激素（20-hydroxyecdysone,20E）信號通路中的關鍵基因進行功能研究,闡明JH和20E調控家蠶個體發(fā)育的分子機制,構建高產(chǎn)量的家蠶品系;第二,整合轉基因、基因定點敲除和敲入等多種遺傳操作手段構建家蠶雌性特異胚胎致死系統(tǒng),實現(xiàn)專養(yǎng)雄蠶,提高蠶絲質量。相關研究成果可為家蠶經(jīng)濟性狀改良提供理論基礎,具體研究內容和結果如下:1.家蠶保幼激素代謝通路中BmJHE基因的功能研究保幼激素酯酶（JH esterase,JHE）是昆蟲JH代謝通路中最為關鍵... 

【文章來源】：華東師范大學上海市 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學位級別】：博士

【文章目錄】：
中文摘要
abstract
第一章 緒論
    1.1 昆蟲激素在調控體型大小方面發(fā)揮著中重要作用
    1.2 保幼激素控制昆蟲體型大小的研究進展
        1.2.1 保幼激素的合成
        1.2.2 保幼激素的代謝
        1.2.3 保幼激素受體以及下游信號通路
        1.2.4 保幼激素調節(jié)體型大小的研究進展
    1.3 蛻皮激素控制昆蟲體型大小的研究進展
        1.3.1 蛻皮激素的合成
        1.3.2 蛻皮激素的代謝
        1.3.3 蛻皮激素受體以及下游信號通路的研究進展
        1.3.4 蛻皮激素調控體型大小的研究進展
    1.4 營養(yǎng)信號通路控制昆蟲體型大小的研究進展
    1.5 本研究的目的和意義
第二章 家蠶保幼激素代謝通路中BmJHE基因的功能研究
    2.1 引言
    2.2 材料與方法
        2.2.1 材料
        2.2.2 轉基因質粒構建
        2.2.3 遺傳轉化和轉基因陽性個體篩選
        2.2.4 RNA提取、純化和cDNA合成
        2.2.5 實時熒光定量PCR
        2.2.6 基因組DNA提取
        2.2.7 突變分析
        2.2.8 反向PCR
        2.2.9 保幼激素酯酶活性檢測
        2.2.10 轉錄組分析
        2.2.11 幼蟲生長情況統(tǒng)計
        2.2.12 經(jīng)濟性狀統(tǒng)計
        2.2.13 數(shù)據(jù)分析
    2.3 實驗結果
        2.3.1 BmJHE-sgRNA轉基因質粒的構建
        2.3.2 轉基因品系構建和插入位點檢測
        2.3.3 轉基因CRISPR/Cas9介導BmJHE敲除和突變檢測
        2.3.4 BmJHE基因突變影響保幼激素酯酶酶活性
        2.3.5 BmJHE基因突變延長家蠶幼蟲生長周期
        2.3.6 轉錄組分析篩選BmJHE突變體中的差異表達基因
    2.4 討論
    2.5 小結
第三章 家蠶蛻皮激素合成通路中BmTorso基因的功能研究
    3.1 引言
    3.2 材料與方法
        3.2.1 材料
        3.2.2 轉基因質粒構建
        3.2.3 遺傳轉化和轉基因陽性個體篩選
        3.2.4 RNA提取、純化和cDNA合成
        3.2.5 實時熒光定量PCR
        3.2.6 基因組DNA提取
        3.2.7 突變分析
        3.2.8 蛻皮激素滴度測定
        3.2.9 蛋白提取
        3.2.10 免疫印記分析
        3.2.11 轉錄組分析
        3.2.12 幼蟲生長情況統(tǒng)計
        3.2.13 經(jīng)濟性狀統(tǒng)計
        3.2.14 數(shù)據(jù)分析
    3.3 實驗結果
        3.3.1 BmTorso-sgRNA轉基因質粒的構建
        3.3.2 轉基因品系構建和插入位點檢測
        3.3.3 轉基因CRISPR/Cas9介導BmTorso敲除和突變檢測
        3.3.4 BmTorso突變延長家蠶幼蟲發(fā)育時間
        3.3.5 BmTorso基因突變對蛻皮激素滴度的影響
        3.3.6 BmTorso基因突變對蛻皮激素信號通路基因表達的影響
        3.3.7 轉錄組分析篩選BmTorso基因突變體中的差異表達基因
    3.4 討論
    3.5 小結
第四章 家蠶雌性特異胚胎致死系統(tǒng)的構建研究
    4.1 引言
    4.2 材料與方法
        4.2.1 材料
        4.2.2 W染色體隨機擴增多態(tài)性DNA標記Rikishi序列驗證
        4.2.3 類轉錄激活因子核酸酶表達質粒和活性檢測質粒構建
        4.2.4 類轉錄激活因子核酸酶切割活性檢測
        4.2.5 體外轉錄mRNA
        4.2.6 配體質粒構建
        4.2.7 特異性表達Tra2-sgRNA轉基因質粒構建
        4.2.8 類轉錄激活因子核酸酶介導的定點整合和陽性個體篩選
        4.2.9 Tra2-sgRNA轉基因質粒的遺傳轉化和轉基因陽性個體篩選
        4.2.10 反向PCR
        4.2.11 定點插入位點檢測和靶基因突變分析
        4.2.12 RNA提取、純化和cDNA合成
        4.2.13 逆轉錄PCR
    4.3 實驗結果
        4.3.1 類轉錄激活因子核酸酶特異性靶點設計和配體質粒構建
        4.3.2 雌性特異性表達熒光家蠶品系的構建
        4.3.3 接頭PCR驗證W染色體特異性定點插入
        4.3.4 雌性特異性胚胎致死品系的構建
    4.4 討論
    4.5 小結
第五章 總結與展望
    5.1 研究總結
    5.2 主要創(chuàng)新點
    5.3 不足與展望
參考文獻
附錄一 實驗主要藥品試劑
附錄二 實驗主要儀器
附錄三 攻讀博士學位期間發(fā)表的學術論文及參與的項目
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
[1]家蠶限性育種研究進展[J]. 丁華靜,喻蕾,魏國清,趙小明,劉朝良.  蠶桑茶葉通訊. 2012(04)
[2]多環(huán)境條件下家蠶主要經(jīng)濟性狀雜種優(yōu)勢表現(xiàn)[J]. 何克榮,柳新菊,祝新榮,陳詩,夏建國,孟智啟,俞碧華.  蠶桑通報. 2011(01)
[3]保幼激素合成的研究進展[J]. 劉艷,勝振濤,蔣容靜,黃原,李勝.  昆蟲學報. 2007(12)
[4]保幼激素的代謝[J]. 李勝,蔣容靜,曹梅訊.  昆蟲學報. 2004(03)



本文編號：3017186