基因的表達調控與基因組在細胞核內(nèi)的三維空間架構相輔相成,原鈣粘蛋白（protocadherin, Pcdh）基因簇在大腦發(fā)育中起到關鍵作用,可以作為研究基因表達調控機制的模式基因。轉錄因子RFX5 （regulatory factor x 5）是翼螺旋家族（winged HLH family）的成員,其蛋白由寡聚化結構域、DNA結合域、螺旋結構域和激活域組成,在調控免疫系統(tǒng)的主要組織相容性復合物II類（major histocompatibility complex class II, MHC II）的表達中起著至關重要的作用。本研究發(fā)現(xiàn)RFX5與CTCF在全基因組上結合的位點有部分重疊,利用CRISPR/Cas9DNA大片段編輯技術,構建了RFX5基因缺失的HEC-1-B細胞系。通過RNA-seq實驗,發(fā)現(xiàn)RFX5敲除能夠顯著升高Pcdhα6、Pcdhα12、Pcdhαc2的表達水平。通過ChIP-nexus實驗,發(fā)現(xiàn)敲除RFX5導致染色質架構蛋白CTCF和cohesin在原鈣粘蛋白α基因簇處的結合增加。最后,染色質構象捕獲QHR-4C實驗發(fā)現(xiàn)Pcdhα6、Pcdhα12啟動子與遠端... 

【文章來源】：遺傳. 2020,42(08)北大核心

【文章頁數(shù)】：15 頁

【部分圖文】：

使用CRISPR/Cas9技術建立RFX5基因敲除的單細胞克隆株

本研究使用CRISPR/Cas9技術，通過導入兩個sgRNA，將Cas9蛋白定位在目的片段處進行切割，造成DNA雙鏈斷裂，經(jīng)細胞修復機制得到RFX5基因敲除的單細胞克隆株K30和K56。K30的兩條染色體有一個堿基不同，而K56兩條染色體基因型相同。本研究對這兩個單細胞克隆株的RNA-seq、ChIP-nexus、以及染色質構象捕獲實驗發(fā)現(xiàn)，RFX5敲除后，Pcdhα6、Pcdhα12、Pcdhαc2轉錄升高。推測這些轉錄水平變化是由于RFX5敲除后，蛋白CTCF和cohesin在原鈣粘蛋白α基因簇的結合升高，使得增強子與啟動子之間的染色質相互作用增加而導致的(圖5)。該現(xiàn)象表明RFX5蛋白通過抑制CTCF和cohesin與DNA的結合調控染色質高級結構，從而參與原鈣粘蛋白α基因簇的轉錄調控(圖5)。然而通過ChIP-nexus和染色質構象捕獲QHR-4C實驗，發(fā)現(xiàn)敲除RFX5基因后，原鈣粘蛋白α基因簇中啟動子以及增強子HS5-1處的CTCF和cohesin的結合水平升高。在RFX5敲除的單細胞克隆株中，Pcdhα6和Pcdhα12啟動子處的CTCF/cohesin結合增加，以及這兩個啟動子與增強子HS5-1之間的染色質相互作用增加，這些均能解釋Pcdhα6和Pcdhα12這兩個基因轉錄水平升高的現(xiàn)象。但是，RFX5的敲除如何上調Pcdhαc2的轉錄水平仍是未解決的問題。Pcdhαc2是原鈣粘蛋白α基因簇的特殊一員，它的啟動子上沒有CTCF蛋白的結合，并且它的轉錄不受增強子HS5-1的調控，而是由另外一個增強子HS7調控[12,57,58]。本研究在Pcdhαc2的啟動子上沒有發(fā)現(xiàn)RFX5的結合，但在增強子HS7上發(fā)現(xiàn)有RFX5的強結合，說明RFX5可能通過結合增強子HS7調控Pcdhαc2的轉錄。

基于RFX5對CTCF和cohesin復合體在原鈣粘蛋白α基因簇位點結合水平的影響，推測RFX5可能通過影響染色質三維空間構象從而調控原鈣粘蛋白α基因簇的表達，因此對原鈣粘蛋白α基因簇進行可定量的高分辨率染色質構象捕獲(QHR-4C)實驗。該實驗能夠研究某個觀測點(viewpoint,VP)與全基因組其他位點之間的空間關系[15]。本研究首先以增強子HS5-1為觀測點，發(fā)現(xiàn)在野生型細胞中，HS5-1與Pcdhαc1以及Pcdhα6-Pcdhα12之間形成遠距離的染色質環(huán)(圖4A)。在RFX5敲除的兩個單細胞克隆株K30和K56中，HS5-1與這些基因之間的遠距離相互作用增加(圖4A)。為了進一步確定這些基因組位點間空間結構的變化，選取Pcdhα12啟動子為觀測點，發(fā)現(xiàn)在RFX5基因敲除的兩個單細胞克隆株中，Pcdhα12與增強子HS5-1之間的遠距離相互作用也同樣增加(圖4B)。這些結果說明，敲除RFX5基因后，原鈣粘蛋白α基因簇啟動子與遠端增強子HS5-1之間的染色質相互作用增強，這可能是Pcdhα基因表達上調的原因。綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)敲除RFX5基因導致原鈣粘蛋白α基因簇表達升高，并且RFX5會阻礙CTCF蛋白和cohesin蛋白復合體在原鈣粘蛋白α基因簇的結合。此外，RFX5參與調控染色質環(huán)的形成，進而影響染色質三維空間結構。

【參考文獻】：
期刊論文
[1]CRISPR/Cas9基因編輯在三維基因組研究中的應用[J]. 劉沛峰,吳強.  遺傳. 2020(01)
[2]原鈣粘蛋白基因簇調控區(qū)域中成簇的CTCF結合位點分析[J]. 翟亞男,許泉,郭亞,吳強.  遺傳. 2016(04)
[3]CRISPR/Cas9系統(tǒng)在基因組DNA片段編輯中的應用[J]. 李金環(huán),壽佳,吳強.  遺傳. 2015(10)
[4]人類原鈣粘蛋白基因簇調控元件的克隆及對其啟動子活性的影響[J]. 吳海洋,郭亞,李偉,吳強.  生命科學研究. 2014(02)



本文編號：3015900