利用功能缺失型（Loss-of-function）或者功能獲得型（Gain-of-function）策略高通量篩選功能基因,是研究人員快速尋找調(diào)控特定表型的重要或關(guān)鍵基因的主要方法。RNA干擾（RNA interference,RNAi）的遺傳篩選方法因操作簡(jiǎn)單、成本相對(duì)較低等優(yōu)勢(shì),盡管已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用,然而其抑制效果不完全、脫靶效應(yīng)明顯等劣勢(shì)依然存在。近年來(lái)興起的CRISPR/Cas9（Clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences/CRISPR-associated protein 9）技術(shù)能快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確地實(shí)現(xiàn)基因組敲除等編輯功能,因而成為一種強(qiáng)大的遺傳篩選工具;在各種細(xì)胞系、人和小鼠及斑馬魚(yú)等多種模式動(dòng)物中,大規(guī)模運(yùn)用該方法篩選功能基因已經(jīng)取得了巨大成功。本文總結(jié)了CRISPR/Cas9技術(shù)的特點(diǎn),將其與傳統(tǒng)基因工程方法進(jìn)行了分析比較,回顧了近期相關(guān)的高通量功能基因篩選工作,最后探討了該技術(shù)未來(lái)的發(fā)展趨勢(shì)。 

【文章來(lái)源】：遺傳. 2016,38(05)北大核心

【文章頁(yè)數(shù)】：11 頁(yè)

【部分圖文】：

Cas9、sgRNA與DNA相互作用示意圖

抵薪?辛?篩眩首先他們?cè)趩伪扼w細(xì)胞系KBM7中以對(duì)6-硫代鳥(niǎo)嘌呤(6-thioguanine，嘌呤類似物)細(xì)胞致死作用的抗性為表型，篩選了參與DNA錯(cuò)配修復(fù)通路(Mismatchrepair，MMR)的基因。MMR-proficient(pMMR，WT)細(xì)胞將無(wú)法修復(fù)6-硫代鳥(niǎo)嘌呤引發(fā)的細(xì)胞損害而停留在G2-M的細(xì)胞周期節(jié)點(diǎn)，而MMR-defective(dMMR，mutation)細(xì)胞將不識(shí)別錯(cuò)配而繼續(xù)分裂。研究者們向Cas9-KBM7細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染了整個(gè)sgRNA文庫(kù)，在濃度足以致死WTKBM76-硫代鳥(niǎo)嘌呤條件下培養(yǎng)，然后對(duì)存活細(xì)胞中表達(dá)的sgRNA進(jìn)行測(cè)序。與預(yù)期的結(jié)果一致，觀察到被富圖2哺乳動(dòng)物細(xì)胞中利用慢病毒CRISPR-Cas9系統(tǒng)的遺傳篩選流程Fig.2FlowchartofgeneticscreeninginmammaliancellsbyusingalentiviralCRISPR-Cas9system

396遺傳Hereditas(Beijing)2016第38卷圖3利用小鼠全基因組CRISPR-Cas9敲除文庫(kù)(mGeCKOa)的腫瘤生長(zhǎng)和遷移篩選Fig.3CRISPRscreenoftumorgrowthandmetastasiswithmGeCKOalibrary細(xì)胞系，再用sgRNA混合文庫(kù)侵染。在培養(yǎng)1周之后，文庫(kù)穩(wěn)定表達(dá)并具有足夠的拷貝數(shù)與均勻性，然后將該細(xì)胞系(mGeCKOa-transduced)與對(duì)照組細(xì)胞系(Untransduced)各自移植到小鼠體內(nèi)，并分別對(duì)早期腫瘤與晚期腫瘤的樣本進(jìn)行分析。研究者們發(fā)現(xiàn)，經(jīng)文庫(kù)侵染的一些細(xì)胞最終具有高遷移能力，而對(duì)照組細(xì)胞系形成的腫瘤均不具有遷移性。利用第二代測(cè)序技術(shù)，研究者們分別鑒定了在腫瘤原位與轉(zhuǎn)移灶處被敲除的基因，這些基因的功能可能是抑制腫瘤生長(zhǎng)或遷移。在這些結(jié)果中，排名較高者包含了之前已經(jīng)被報(bào)道過(guò)的腫瘤抑制基因，NF2、Pten和Cdkn2a。此外，還有一些microRNA，如miR-345、miR152。Chen等[19]的工作為體內(nèi)CRISPR篩選提供了一個(gè)完整的路線圖，這個(gè)模型在未來(lái)可能被更廣泛的應(yīng)用于疾病的體內(nèi)研究。全基因組CRISPR篩選可以應(yīng)用于幾乎任何細(xì)胞系和任何遺傳背景下的遺傳篩選，比如EGFR、KRAS、ALK突變型，或其他人類腫瘤細(xì)胞系。而采用其他的遞送方法，比如靜脈注射或原位移植，將有助于鑒定那些在腫瘤外滲和成血管化過(guò)程中起作用的基因。此外，檢測(cè)不同時(shí)期與位置的腫瘤樣本，如循環(huán)腫瘤細(xì)胞(Circulatingtumorcells，CTCs)或已遷移腫瘤，可以更好的理解腫瘤在體內(nèi)的演化過(guò)程。除此之外，體內(nèi)CRISPR篩選模型還可以進(jìn)行更細(xì)致的調(diào)整，以適應(yīng)不同的實(shí)驗(yàn)需要。將體內(nèi)篩選策略與藥物治療或免疫治療共同運(yùn)用，可以鑒定功能與抗性有關(guān)的基因。利用其他的篩選技術(shù)，如Cas9激活技術(shù)(Cas9-mediatedactivation)，可以作為一種功能獲得性篩選策略，鑒定在腫瘤遷移

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]CRISPR/Cas9的應(yīng)用及脫靶效應(yīng)研究進(jìn)展[J]. 鄭武,谷峰.  遺傳. 2015(10)
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[3]CRISPR/Cas系統(tǒng):RNA靶向的基因組定向編輯新技術(shù)[J]. 李君,張毅,陳坤玲,單奇?zhèn)?王延鵬,梁振,高彩霞.  遺傳. 2013(11)



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