棉花作為一種自然纖維、植物蛋白和食用油的重要來源,具有非常重要的經(jīng)濟和社會價值。現(xiàn)在異源四倍體棉花的種植最為廣泛,其基因組大而復(fù)雜的特點給棉花基因和基因組功能的研究提出了挑戰(zhàn),但科學(xué)家一直在探索和發(fā)明新的生物技術(shù)去更為有效和精準(zhǔn)地研究棉花的基因功能。CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為一種最新的基因組編輯技術(shù),由于具有簡單、高效、靈活、低廉的優(yōu)點,自從出現(xiàn)以來就被廣泛應(yīng)用于多種物種的基因組編輯研究。本研究利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對陸地棉GhCLA1和GhVP基因進(jìn)行了定點突變,分別在棉花子葉原生質(zhì)體和轉(zhuǎn)基因植株中檢測了該系統(tǒng)對兩個基因的編輯情況,還在轉(zhuǎn)基因植株中檢測了CRISPR/Cas9系統(tǒng)的脫靶情況。針對棉花構(gòu)建了棉花特異性的CRISPR/Cas9系統(tǒng)表達(dá)載體,初步在棉花子葉原生質(zhì)體中對GhVP基因進(jìn)行了定點突變研究,同時也利用Cas9-sgRNA蛋白（RNP）復(fù)合體對GhVP基因在體外和體內(nèi)的編輯效果進(jìn)行了初步研究。主要結(jié)果如下:1.利用半定量PCR對棉花GhCLA1和GhVP基因的表達(dá)情況進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)兩個基因的表達(dá)均比較活躍,可以作為基因編輯的靶標(biāo)。針對GhCLA1和GhVP... 

【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：82 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的棉花莖尖遺傳轉(zhuǎn)化

圖 3.1 GhCLA1 和 GhVP 基因表達(dá)水平的 RT-PCR 檢測Fig. 3.1 Detection of expression levels of GhCLA1 and GhVP gene 3.2 GhCLA1 和 GhVP 基因 sgRNA 的設(shè)計為了簡化后續(xù)實驗操作，利于采用 RE-PCR 的方法驗證靶標(biāo)序列首先將得到的兩個基因的所有 sgRNA 進(jìn)行酶切位點分析，挑選 PAM合適酶切位點的 sgRNA 用于下一步的篩選。由于在線軟件 CRISPR-有雷蒙德氏棉的基因組序列數(shù)據(jù)，所以將上一步得到的 sgRNA 在陸地數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行相似性比對，每個基因篩選特異性最強的 5 個 sgRNA 作序列（表 3.1）。對 GhCLA1 和 GhVP 基因的 5 個sgRNA 分別經(jīng)在棉花子葉原生質(zhì)編輯的功能鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn) GhCLA1-sgRNA5 和 GhVP-sgRNA4 對靶

和 PAM 序列在相應(yīng)亞基因組上的序列是完全一致的。表 3.1 GhCLA1 和 GhVP 基因的靶標(biāo)位點序列Table 3.1 Target sites of GhCLA1 and GhVP gene基因 命名 靶標(biāo)位點序列及 PAM 序列 酶切位點GhCLA1 sgRNA1 AGTTCAACCACAATCTCTGCAGG PstIsgRNA2 CCTAGACGTCTTCGACGGACATT PstIsgRNA3 TGGTGTGGTTGAACTCACTGTGG TspRIsgRNA4 CATGCTGTCACCTTTGCTGCAGG PstIsgRNA5 GGTGATGGTGCTATGACTGCAGG PstIGhVP sgRNA1 CCGGTGTGTCCGAGCATGCAAGG SphIsgRNA2 TTTATTGTTGCGTTTAGATCTGG BglIIsgRNA3 CTCGTTGGTGCAGTGGGTGATGG BstIsgRNA4 TCAGTTCTTTCTGGATTCCTTGG HinfIsgRNA5 TAACATTCTTATCAAGCTTATGG HindIII

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Targeted Mutagenesis in Zea mays Using TALENs and the CRISPR/Cas System[J]. Zhen Liang,Kang Zhang,Kunling Chen,Caixia Gao.  Journal of Genetics and Genomics. 2014(02)



本文編號：3007002