研究背景和目的低氧環(huán)境是地球上生物面臨的極端環(huán)境之一,包括高緯度低氧環(huán)境如中國(guó)的青藏高原,地下以及洞穴低氧環(huán)境,和水生哺乳動(dòng)物面臨的周期性低氧環(huán)境等。長(zhǎng)期低氧會(huì)導(dǎo)致機(jī)體在生理和病理上產(chǎn)生一系列不良反應(yīng),嚴(yán)重時(shí)還會(huì)導(dǎo)致許多疾病發(fā)生,如肺纖維化,哮喘,心腦血管疾病等。而在人體的所有器官中大腦的神經(jīng)元對(duì)低氧的耐受性是最低的,因?yàn)槟X組織的能量幾乎全部都來(lái)自于有氧代謝,幾乎沒(méi)有無(wú)氧代謝。近些年來(lái),CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)因?yàn)槠湟撞僮?效率高已廣泛地應(yīng)用在多個(gè)生物科學(xué)領(lǐng)域,并且它作為一種高通量研究基因功能的工具使得從全基因組層面上研究基因?qū)μ囟?xì)胞表型的貢獻(xiàn)成為可能。所以在這一背景下,我們想通過(guò)CRISPR/Cas9全基因組文庫(kù)篩選技術(shù)在神經(jīng)細(xì)胞中找到一些新的低氧耐受基因。研究方法和結(jié)論本研究首先在小鼠神經(jīng)瘤母細(xì)胞細(xì)胞系N2a上優(yōu)化了小鼠全基因組敲除文庫(kù)的慢病毒文庫(kù)感染體系,然后構(gòu)建了包含全基因組文庫(kù)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株,將其低氧處理后收集活細(xì)胞進(jìn)行富集,通過(guò)優(yōu)化測(cè)序建庫(kù)方法后將富集的細(xì)胞進(jìn)行二代測(cè)序,在得到數(shù)據(jù)后利用生物信息學(xué)分析樣本之間的相關(guān)性,后進(jìn)行樣本中基因數(shù)和sgRNA數(shù)目的認(rèn)證,接下... 

【文章來(lái)源】：蘇州大學(xué)江蘇省

【文章頁(yè)數(shù)】：69 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖２－１．實(shí)驗(yàn)流程圖

）；??磁珠法動(dòng)物組織基因組ＤＮＡ提取試劑盒（ＤＰ３４１－０２，天根，中國(guó)）；??２．２．２實(shí)驗(yàn)方法??１．?ＧｅＣＫＯｖ２ｓｇＲＮＡ文庫(kù)準(zhǔn)備：最初的文庫(kù)由焦保衛(wèi)教授實(shí)驗(yàn)室提供，后面??根據(jù)焦保衛(wèi)老師實(shí)驗(yàn)室提供的擴(kuò)大文庫(kù)的步驟進(jìn)行我們自己文庫(kù)的擴(kuò)大培養(yǎng)［３０］。??Ｓｉｎｇｌｅ－ｖｅｃｔｏｒ?ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ?ＧｅＣＫＯ?ｓｙｓｔｅｍ??ｃＰＰＴ??ｐｓｉ＋?ＲＲＥ?Ｕ６?ｓｇＲＮＡ?ＥＦＳ?ＳｐＣａｓ９?Ｆｌａｇ?Ｐ２ＡＰｕｒｏ?ＷＰＲＥ??ｌｅｎｔｉＣＲＩＳＰＲｖ２??圖２－２．優(yōu)化后的病毒載體丨２９丨。??Ｆｉｇｕｒｅ?２－２．?Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ?ｖｉｒｕｓ?ｖｅｃｔｏｒ．??具體步驟如下：??９??

下整個(gè)篩選實(shí)驗(yàn)的流程：在拿到小鼠ＣＲＩＳＰＲ全基因組敲除文庫(kù)??之后，進(jìn)行文庫(kù)的擴(kuò)大培養(yǎng)之后用來(lái)感染目的細(xì)胞系（小鼠神經(jīng)瘤母細(xì)胞），在經(jīng)??過(guò)多次實(shí)驗(yàn)摸索之后確定感染條件保證絕大部分細(xì)胞每個(gè)細(xì)胞只感染一條??ｓｇＲＮＡ，構(gòu)建好目的細(xì)胞系的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株后，放在１％的低氧環(huán)境下分別處理７２??小時(shí)和９６小時(shí)，不適應(yīng)這種環(huán)境的細(xì)胞就會(huì)死掉，而活下來(lái)的細(xì)胞里面可能就存??在較為感興趣的基因。再將這些細(xì)胞富集到一定數(shù)量時(shí)，提取其基因組ＤＮＡ，擴(kuò)??增出ｓｇＲＮＡ片段之后送去測(cè)序，后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。圖２－３為整個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的流程??圖［３１］：??Ｐｏｓｉｔｉｖｅ?ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ：?Ｎｅｇａｔｉｖｅ?ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ：??—７Ｔ＼?ｆ￣ｒ＼—＾?ｒ＊ｖ?Ｉ?ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ?ｏｆ?ｃｌｏｎｅｓ?ｌｏｓｓ?ｏｆ?ｅｓｓｅｎｔｉａｌ?ｇｅｎｅｓ??圓？國(guó)？國(guó)？圍??ｌ．Ｏｌｉｇｏ?２．Ｐｌａｓｍｉｄ?３．Ｖｉｒｕｓ?々．Ｉｎｔｒｏｄｕｃｅ?＼＿ｙ??ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ?ｐｏｏｌ?ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ?ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎｓ?Ｓ．Ｃｏｎｄｕｃｔ?ａ?ｓｃｒｅｅｎ?ｗｉｔｈ?ｐｏｓｉｔｉｖｅ??ｔｏ?ｃｅｌｌｓ?ｏｒ?ｎｅｇａｔｉｖｅ?ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ??ｓｇＲＮＡ?丨ｎｉｔ．?Ｐｏｓ．?Ｎｅｇ．???????１６?０?０?？？？？？？？？?Ｎ?？?￣￣??￣＾￣＾￣ｇＤＮＡ－ｖｅｃｔｏｒ－ｓｇＲＮＡ－ｖｅｃｔｏｒ－ｇＤＮＡ??—１７?〇—＾—??丨?■?■—?７．Ｎｅｘｔ?ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ?６．ＰＣＲ?ｇｅｎｏｍｉｃ?ＤＮＡ??８．Ｍａｔｒｉｘ?ｏｆ?ｓｇＲ

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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