牛支原體（Mycoplasma bovis,M.b）是牛（Bos taurus）的一種重要致病性支原體,感染后可引起牛多種疾病。丙酮酸脫氫酶復(fù)合體E1（pyruvate dehydrogenase E1,PDHc E1）是參與生物體糖代謝過(guò)程的一個(gè)限速酶,廣泛存在于微生物、哺乳動(dòng)物及高等植物中,其直接影響丙酮酸向乙酰輔酶A的轉(zhuǎn)化。本研究參照Gen Bank中M.b PG45株的PDHc E1α亞基基因pdhα和PDHc E1β亞基基因pdhβ序列設(shè)計(jì)引物,通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得M.b武威株的pdhα（Gen Bank登錄號(hào):KU355295）及pdhβ基因（Gen Bank登錄號(hào):KU355296）,在序列測(cè)定的基礎(chǔ)上應(yīng)用重疊延伸PCR（Overlap PCR）技術(shù)完成基因優(yōu)化并構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒p ET-pdhα和p ET-pdhβ。表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3）后經(jīng)異丙基硫代半乳糖苷（isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG）誘導(dǎo)表達(dá)重組PDHc E1α亞基融合蛋白PDHA及PDHc E1β亞基蛋白... 

【文章來(lái)源】：農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào). 2016年04期 北大核心

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1α和E1β亞基在牛支原體細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中分布

亞細(xì)胞定位鑒定相類似，故定位于牛支原體細(xì)胞膜的E1α和E1β亞基是否具有與其他支原體及病原菌外向酶相似的生物學(xué)功能，如粘附、入侵、免疫逃逸、圖9E1α和E1β亞基在牛支原體細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中分布的ELISA分析Figure9ELISAanalysisofdistributionofE1αandE1βsubunitsinthemembraneandcytoplasmfromM.b空白Blankcontrolα-亞基抗血清Anti-PDHAβ-亞基抗血清Anti-PDHB00.050.100.150.200.250.300.350.400.450.50膜蛋白Membraneprotein胞漿蛋白CytosolproteinDO504圖7重組融合蛋白rPDHA和rPDHB的SDS-PAGE分析Figure7SDS-PAGEanalysisofrecombinantproteinsrPDHAandrPDHBM：預(yù)染蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：pET-pdhα表達(dá)菌超聲裂解沉淀；2：pET-pdhα表達(dá)菌超聲裂解上清；3：rPDHA純化產(chǎn)物；4：pET-pdhβ表達(dá)菌超聲裂解沉淀；5：pET-pdhβ表達(dá)菌超聲裂解上清；6：rPDHB純化產(chǎn)物；7：pET-28a(+)轉(zhuǎn)化的表達(dá)菌。M:Prestainedproteinladder;1:Lyticprecipitationofexpres-sionproductsfrompET-pdhα;2:Lyticsupernatantofexpres-sionproductsfrompET-pdhα;3:PurifiedrPDHA;4:Lyticpre-cipitationofexpressionproductsfrompET-pdhβ;5:Lyticsu-pernatantofexpressionproductsfrompET-pdhβ;6:PurifiedrPDHB;7:NegativecontrolM12345675341302218149kD4037kD圖8E1α和E1β亞基在牛支原體細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中分布的Westernblot分析Figure8WesternblotanalysisofdistributionofE1αandE1βsubunitsinthemembraneandcytoplasmfromM.bM：預(yù)染蛋白分子標(biāo)準(zhǔn)；A1：rPDHA；B1：rPDHB；A2、B2：全菌蛋白；A3、B3：疏水性蛋白；A4、B4：親水性蛋白M:Prestainedproteinladder;A1

ㄎ煌ǔ？煞治??餉浮??內(nèi)酶及共價(jià)鍵連接在細(xì)胞表面的外向酶等，而外向酶的功能是目前細(xì)菌學(xué)研究的熱點(diǎn)。Thomas等(2013)等對(duì)肺炎支原體的研究表明，肺炎支原體E1β是一種血纖維蛋白溶酶原結(jié)合相關(guān)蛋白，并且E1β被遞呈在肺炎支原體的細(xì)胞膜上；而Dallo等(2002)證明肺炎支原體的E1β同樣被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜表面，并結(jié)合纖連蛋白進(jìn)行感染。這與本研究的亞細(xì)胞定位鑒定相類似，故定位于牛支原體細(xì)胞膜的E1α和E1β亞基是否具有與其他支原體及病原菌外向酶相似的生物學(xué)功能，如粘附、入侵、免疫逃逸、圖9E1α和E1β亞基在牛支原體細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中分布的ELISA分析Figure9ELISAanalysisofdistributionofE1αandE1βsubunitsinthemembraneandcytoplasmfromM.b空白Blankcontrolα-亞基抗血清Anti-PDHAβ-亞基抗血清Anti-PDHB00.050.100.150.200.250.300.350.400.450.50膜蛋白Membraneprotein胞漿蛋白CytosolproteinDO504圖7重組融合蛋白rPDHA和rPDHB的SDS-PAGE分析Figure7SDS-PAGEanalysisofrecombinantproteinsrPDHAandrPDHBM：預(yù)染蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：pET-pdhα表達(dá)菌超聲裂解沉淀；2：pET-pdhα表達(dá)菌超聲裂解上清；3：rPDHA純化產(chǎn)物；4：pET-pdhβ表達(dá)菌超聲裂解沉淀；5：pET-pdhβ表達(dá)菌超聲裂解上清；6：rPDHB純化產(chǎn)物；7：pET-28a(+)轉(zhuǎn)化的表達(dá)菌。M:Prestainedproteinladder;1:Lyticprecipitationofexpres-sionproductsfrompET-pdhα;2:Lyticsupernatantofexpres-sionproductsfrompET-pdhα;3:PurifiedrPDHA;4:Lyticpre-cipitationofexpressionproductsfrompET-pdhβ;5:Lyticsu-pernatantofexpressionproductsfrompET-pdhβ;6:PurifiedrPDHB;7:NegativecontrolM

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]綿羊肺炎支原體（Mycoplasma ovipneumoniae）丙酮酸脫氫酶E1-α亞單位基因（pdha）的克隆、表達(dá)及其免疫學(xué)活性測(cè)定[J]. 許健,儲(chǔ)岳峰,高鵬程,趙萍,賀英,剡根強(qiáng),逯忠新.  農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào). 2012(03)
[2]國(guó)內(nèi)首次從患肺炎的犢牛肺臟中分離到牛支原體[J]. 辛九慶,李媛,郭丹,宋念華,胡守萍,陳超,裴潔,曹培麗.  中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào). 2008(09)



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