發(fā)布時間：2020-11-14 11:52

　　 植物遠(yuǎn)緣雜交和多倍體化是新物種形成的主要途徑,也是促進(jìn)植物進(jìn)化的重要動力。由于親本基因組間的相互作用,異源多倍體化大多伴隨著廣泛的,快速的遺傳及表觀遺傳變異。高分子量谷蛋白亞基(HMW-GS)是小麥胚乳中重要的貯藏蛋白之一,其組成和含量決定了面團(tuán)彈性和面包加工品質(zhì)。節(jié)節(jié)麥(Aegilops tauschii Cosson,2n=2x=14,DD)和黑麥(Secale cereale,2n=2x=14,RR)含有許多優(yōu)良的農(nóng)藝性狀,被廣泛應(yīng)用于小麥的遺傳改良,本研究以節(jié)節(jié)麥-黑麥雙二倍體(2n=4x=28,DDRR)及其親本為材料,通過定向缺失亞克隆的方法獲取HMW-GS基因序列,對序列進(jìn)行比對,分析HMW-GS基因在雙二倍體中的序列變異特點(diǎn),為深入研究遠(yuǎn)緣雜交過程中由于外源基因組導(dǎo)入引起的功能基因序列改變提供理論依據(jù)。取得的研究成果如下:(1)根據(jù)HMW-GS基因序列兩端有高度的保守性,設(shè)計(jì)引物對節(jié)節(jié)麥-黑麥雙二倍體以及親本進(jìn)行PCR擴(kuò)增,親本節(jié)節(jié)麥和黑麥分別擴(kuò)增出兩條帶,雙二倍體共檢測到三條帶,雙二倍體中分子量最大條帶和最小條帶與親本節(jié)節(jié)麥的Dx5和Dy10.5亞基基因大小一致,中間條帶是兩親本都未出現(xiàn)的新麥谷蛋白條帶,而黑麥的Rx2和Ry6.5亞基基因在雙二倍體材料中未檢測到,由于HMW-GS基因序列分子量較大且內(nèi)部存在大量重復(fù)序列,針對此問題需要利用亞克隆方法獲得基因的全長序列,節(jié)節(jié)麥中的HMW-GS基因暫命名為At-Dx5、At-Dy10.5,黑麥中的HMW-GS基因暫命名為Sc-Rx2、Sc-Ry6.5,節(jié)節(jié)麥-黑麥雙二倍體中的HMW-GS基因暫命名為AS-Dx5、AS-Rx7*、AS-Dy10.5。(2)節(jié)節(jié)麥At-Dx5、At-Dy10.5亞基基因序列全長分別為2514 bp、1968 bp,和它們遷移率一致的雙二倍體中的AS-Dx5和AS-Dy10.5基因序列全長也為2514 bp和1968 bp。利用ClustalX2和Bioedit軟件分別對At-Dx5和AS-Dx5、At-Dy10.5和AS-Dy10.5基因序列比對,結(jié)果發(fā)現(xiàn)作為母本節(jié)節(jié)麥的HMW-GS基因(x-型和y-型)在雙二倍體中變化很小,僅有個別的SNP差異。(3)雙二倍體中新HMW-GS基因AS-Rx7*序列全長為2196 bp,與親本黑麥Sc-Rx2和Sc-Ry6.5基因核苷酸比對發(fā)現(xiàn),AS-Rx7*基因的核苷酸序列的前半部分1-948 bp以及結(jié)尾部分2305-2196 bp與親本黑麥的Rx亞基基因基本一致,948-2305 bp之間有部分與親本黑麥的Ry亞基基因一致,于是我們推測新亞基可能是由于親本黑麥Rx和Ry亞基基因通過不等交換產(chǎn)生的。AS-Rx7*亞基與已知的Rx亞基氨基酸比對結(jié)果顯示AS-Rx7*亞基在靠近N-端非重復(fù)區(qū)的中央重復(fù)區(qū)比其它Rx亞基多含有一個半胱氨酸殘基,因此我們猜測該亞基可能具有提高面粉加工品質(zhì)的潛能。將AS-Rx7*基因的核苷酸序列與親本x-型、y-型亞基基因的核苷酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建,AS-Rx7*基因與黑麥Sc-Rx2基因聚在了一起,說明與黑麥Rx亞基親緣關(guān)系更近。AS-Rx7*亞基在原核細(xì)胞中成功表達(dá),它的條帶遷移率與種子蛋白Rx亞基基因的條帶基本一致。
【學(xué)位單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S512.1
【部分圖文】：

圖 3-1 節(jié)節(jié)麥-黑麥雙二倍體及其親本 HMW-GS 基因的 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖M：DL2000 DNA marker；1：雙二倍體；2：黑麥；3：節(jié)節(jié)麥Fig. 3-1 PCR amplification products electrophoresis of HMW-GS gene in DDRR and its parenM: DL2000 DNA marker; 1: The amphidiploid; 2: S.cereale; 3: Ae. tauschii

圖 3-2 對 AS-Dx5 缺失亞克隆進(jìn)行單酶切的線性質(zhì)粒電泳圖Fig. 3-2 Linear plasmid electropherograms for single digestion of AS-Dx5 deletion subclones

長度不同的單鏈，瓊脂糖凝膠檢測并回收純化，檢測結(jié)果如圖 3-2 所示，瓊脂糖凝膠收純化后自連形成一系列的缺失亞克隆。用M13R/F通用引物PCR檢測菌落片段長度果如圖 3-3 所示，篩選出片段大小合適的亞克隆，通過亞克隆測序拼接獲得它們的全列。圖 3-2 對 AS-Dx5 缺失亞克隆進(jìn)行單酶切的線性質(zhì)粒電泳圖Fig. 3-2 Linear plasmid electropherograms for single digestion of AS-Dx5 deletion subclones
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本文編號：2883444