轉(zhuǎn)錄調(diào)控在真核生物的基因表達中有著至關(guān)重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)RNA聚合酶Ⅱ(PolⅡ)可以暫停在許多基因的轉(zhuǎn)錄起始位點下游30-50bp處。當(dāng)接受一定刺激后,正性轉(zhuǎn)錄延伸因子P-TEFb可磷酸化位于RNA PolⅡ碳端結(jié)構(gòu)域(CTD)中7肽重復(fù)序列的2位絲氨酸(Serine 2),釋放PolⅡ,激活轉(zhuǎn)錄,進而合成全長mRNA。HEXIM蛋白家族包括HEXIM1和HEXIM2蛋白,兩者的序列具有很強的同源性,在功能上也十分相似。HEXIM家族中HEXIM1與HEXIM2蛋白可以以同源二聚體或異源二聚體的形式參與7SK snRNP的形成。7SK snRNP復(fù)合物可以通過與P-TEFb的結(jié)合抑制活性,在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中主要起抑制的作用。然而,兩者在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中是否存在功能差異性目前尚不清楚。為了探究HEXIM家族兩種蛋白在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的作用,我們首先制備了特異性的識別HEXIM1和HEXIM2的抗體。并且利用CRISPR-Cas9技術(shù)分別構(gòu)建了HEXIM1和HEXIM2敲除的HCT 116穩(wěn)定細胞系,用于后續(xù)實驗。通過Q-PCR和Western Blot結(jié)果結(jié)果顯示在RNA和蛋白水平上HEXIM1敲除后HEXIM2的表達上調(diào);而HEXIM2敲除后HEXIM1的表達亦會上調(diào),提示HEXIM1和HEXIM2可能存在功能上的代償。隨后進行的血清饑餓處理研究時發(fā)現(xiàn)HEXIM1敲除后C-FOS,C-JUN和EGR1的表達量下調(diào),而HEXIM2敲除后C-FOS和C-JUN的表達量上調(diào)。為了進一步探究造成兩者差異性的機制,我們通過ChIP實驗探究在血清刺激后HEXIM蛋白敲除后對于PolⅡ和AFF4在C-FOS位點的富集情況。結(jié)果表明HEXIM1敲除后并不影響PolⅡ和AFF4的富集;而HEXIM2敲除后PolⅡ在啟動子和下游基因處的富集均顯著增加,而AFF4在啟動子處的富集也增加。因此HEXIM1和HEXIM2在分子水平上對CFOS的調(diào)控存在功能差異性;HEXIM2可能通過影響超級延伸復(fù)合物(SEC)參與的PolⅡ重新釋放的過程。然而,HEXIM1和HEXIM2的具體調(diào)控機制還需要進一步的研究。
【學(xué)位單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：Q753
【部分圖文】：

端的乙�；嚢彼嵯嗷プ饔�，然后通過 Cyclin T1細胞中用 BET 蛋白抑制劑處理后發(fā)現(xiàn)許多基因的轉(zhuǎn)可以認為 BRD4 通過募集 P-TEFb 參與 PolⅡ的釋放的過程如圖 1所示。

SEC 的 ELL 相關(guān)蛋白 EAF1 和 EAF2 可以和中介體復(fù)合物的亞基MED26 相互作用[26]。而 SEC 的 AF9和 ENL 被證實可以與 PolⅡ相關(guān)蛋白 PAF相互作用[27]。因此認為共因子 MED26 和 PAF1 參與 SEC 的募集，從而調(diào)控基因的表達。模式圖如 1.1c所示。

析發(fā)現(xiàn) HEXIM1 蛋白含有 C 端的 SH3和錨定結(jié)構(gòu)域（C心區(qū)域含有進化上保守的 PYNT 序列，在 PYNT 序列的列（NLS），結(jié)構(gòu)如圖 2.1a 所示[38]。HEXIM2 蛋白同樣含構(gòu)域，PYNT 序列和一個核定位序列，結(jié)構(gòu)如圖 2.1b 所示
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本文編號：2883291