碳代謝物抑制(Carbon Catabolite Repression,CCR)是指在多種碳源存在條件下,細(xì)菌優(yōu)先利用優(yōu)勢碳源,同時抑制非優(yōu)勢碳源的利用達(dá)到最佳生長的現(xiàn)象。研究表明,RNA結(jié)合蛋白(如Crc和Hfq)在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)調(diào)控非優(yōu)勢碳源代謝基因的表達(dá),而其與靶標(biāo)的結(jié)合活性受非編碼RNA(ncRNA)的競爭抑制。ncRNA與抑制蛋白之間的數(shù)量關(guān)系影響了菌體對碳源的選擇。優(yōu)勢碳源存在時,RNA結(jié)合蛋白與靶標(biāo)基因mRNA結(jié)合,抑制相關(guān)蛋白表達(dá),菌體不能利用非優(yōu)勢碳源。當(dāng)優(yōu)勢碳源消耗殆盡時,ncRNA高水平表達(dá),與抑制蛋白結(jié)合,靶標(biāo)mRNA得以釋放,細(xì)胞開始利用非優(yōu)勢碳源。參與CCR調(diào)控的ncRNA廣泛存在于假單胞菌中,但不同種中所含的ncRNA種類不同,固氮施氏假單胞菌A1501含有兩個ncRNA CrcZ和CrcY,但其表達(dá)規(guī)律及功能分化尚不清楚。本論文以施氏假單胞菌A1501為試驗材料,探究crcZ和crcY基因在不同營養(yǎng)環(huán)境中的表達(dá)特性及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的穩(wěn)定性,取得的主要結(jié)果如下:1.分別構(gòu)建了ncRNA crcZ和crcY的啟動子-lacZ融合表達(dá)載體PcrcZ-lacZ和PcrcY-lacZ,用于研究不同營養(yǎng)環(huán)境下crcZ和crcY的啟動子活性。β-半乳糖苷酶酶活測定結(jié)果表明,crcZ在LB培養(yǎng)條件下啟動子活性最低,為85 U,以優(yōu)勢碳源乳酸鈉和非優(yōu)勢碳源葡萄糖為唯一碳源培養(yǎng)條件下的啟動子活性相當(dāng),均為LB豐富培養(yǎng)條件下的4.9倍;crcY在以上三種培養(yǎng)條件下啟動子活性存在顯著差異,LB培養(yǎng)條件下最低,為209 U,乳酸鈉和葡萄糖分別為唯一碳源條件下啟動子活性依次升高,分別是LB培養(yǎng)條件下的2.03倍和3.56倍;相比氮限制條件,固氮條件下crcZ和crcY的啟動子活性均變化不大。碳源匱乏相比碳源豐富條件crcZ和crcY啟動子活性均升高;在以上測定的培養(yǎng)條件下,crcZ的啟動子活性均低于crcY,數(shù)字PCR結(jié)果顯示,CrcZ的胞內(nèi)拷貝數(shù)為crcY的36.8倍,推測這兩個ncRNA的穩(wěn)定性受不同機制調(diào)控。2.熒光定量分析和轉(zhuǎn)錄活性測定結(jié)果表明:苯甲酸為唯一碳源培養(yǎng)條件下,crc(碳代謝抑制控制蛋白編碼基因)突變株中,CrcZ的胞內(nèi)水平和轉(zhuǎn)錄活性分別為野生型的0.016倍和0.3倍,CrcY的胞內(nèi)水平和轉(zhuǎn)錄活性分別為野生型的0.21倍和0.18倍,暗示Crc不僅影響了crcZ和crcY基因轉(zhuǎn)錄,而且可能影響CrcZ的穩(wěn)定性。苯甲酸唯一碳源培養(yǎng)條件下,?crc中cbrB和rpoN的表達(dá)量相比于野生型下降1倍,推測Crc蛋白通過影響cbrB和rpoN的表達(dá)進而正調(diào)控crcZ和crcY的轉(zhuǎn)錄。RNA穩(wěn)定性試驗結(jié)果表明,野生型中CrcZ和CrcY在利福平處理第50 min仍分別保留90%和60%(與處理0 min相比),?crc中CrcZ和CrcY在第17 min即下降50%,表明Crc蛋白正調(diào)控CrcZ和CrcY的穩(wěn)定性。此外,RNA分子伴侶蛋白編碼基因hfq的突變株中CrcZ和CrcY水平逐漸降低,在第50 min分別下降21%和36%,而野生型中CrcZ和CrcY在第5 min即下降約40%。上述結(jié)果表明,CrcZ和CrcY的穩(wěn)定性受到Crc和Hfq蛋白的影響。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明,預(yù)測的施氏假單胞菌A1501 CrcZ和CrcY的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的環(huán)上富含發(fā)揮調(diào)控功能的“CA motif”,其附近存在著RNase E的剪切位點(單鏈AU-rich RNA序列),RNase E可能是CrcZ和CrcY功能調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的一個特異性降解酶。本研究初步探討了不同生長條件、不同調(diào)控節(jié)點突變體中非編碼基因crcZ和crcY的轉(zhuǎn)錄特性及轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物穩(wěn)定性,為深入研究碳代謝物抑制與固氮作用的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機制奠定了理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：Q933
【部分圖文】：

成的圓環(huán)形結(jié)構(gòu)即作為三聚體反應(yīng)的場所，催化活性位點就位于此中央通道內(nèi)(SymmC-端具有一個 KH 家族保守核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域和一個 S1 家族保守核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域組成了供 RNA 分子進入催化活性位點的入口。一旦接近這些結(jié)構(gòu)域，線型 RNA 通過的中央孔（僅允許單鏈 RNA 通過）接近其中一個活性位點；RNA3′末端的磷酸二酯一個磷酸分子攻擊，進而被剪切下來，單鏈 RNA 以 3′→5′的方向逐漸被降解。體外實H 結(jié)構(gòu)域和催化核心在底物捕獲中起關(guān)鍵作用(Wong, 2013)，Carzaniga 等發(fā)現(xiàn) PNPas域通過結(jié)合 5′-UTR 抑制自身翻譯，實現(xiàn) PNPase 的自我調(diào)節(jié)(Carzaniga, 2015)。大腸 還具有穩(wěn)定某些 sRNA 的功能，似乎與其作為一個降解性核酸外切酶的結(jié)論相對 編碼基因 pnp 的刪除造成包括 CyaR 和 RyhB 在內(nèi)的一些 sRNA 的不穩(wěn)定(De Lay, 20RNase Ease E 有兩個主要的結(jié)構(gòu)域：N-端核酸酶結(jié)構(gòu)域和 C-端“腳手架”結(jié)構(gòu)域，供其他降解（圖 1-1）。N-端具有內(nèi)切核酸酶活性；C-端除了 6 個微小結(jié)構(gòu)域，主要為固有無序ekaran, 2003)。RNase E 的 C-端序列整體保守性不高，某些局部序列保守性卻較高。這微小結(jié)構(gòu)域大小為 20-70 個殘基，提供 RNA 降解體其他組分組裝、RNA 底物和細(xì)胞位點(Vanzo, 1998; Callaghan, 2004; Chandran, 2007; Khemici, 2008)。C-端第一個微小結(jié)向序列（MTS），形成親水脂性的螺旋可與質(zhì)膜相互作用。

堿基互補配對形成多個莖環(huán)結(jié)構(gòu)。在所有細(xì)菌和真核生物中部分獨立地正向或負(fù)向改變靶 RNA 的翻譯。不同的小 RN并降解。因此，細(xì)菌小 RNA 與真核生物調(diào)控 mRNA 翻譯的菌及與其同屬的致病菌中，sRNA 并不與其靶 mRNA 完全堿要分子伴侶 Hfq 的協(xié)助，Hfq 在這里起到的作用是穩(wěn)定 s不同 sRNA 與相應(yīng)靶標(biāo) mRNA 相互作用對基因的表達(dá)可以起定性增強翻譯效率或加速 mRNA 降解阻止翻譯。細(xì)菌中大RNA 的半衰期進而影響翻譯(Wagner, 2015)。然而，最新的“降解機器”直接影響 mRNA 穩(wěn)定性，而不影響翻譯(LalaoicC）、mRNA（ompD）和 Hfq 形成的三元復(fù)合物可以招募 R），在不影響 RhlB 和烯醇酶與 RNAse E 結(jié)合的同時，sR 碳端的識別核心區(qū)域相互作用而結(jié)合，這個識別并結(jié)合的過中，sRNA 的 5′端單磷酸基團與 RNase E 的感應(yīng)結(jié)構(gòu)域結(jié)合的結(jié)構(gòu)域(Bandyra, 2012)（圖 1-2）。另外一個例子是，sR點上游 5′-非翻譯區(qū)堿基配對增加 cfa mRNA 的穩(wěn)定性，進, 2013)。

士學(xué)位論文 第二章 CrcZ 和CrcY的生物信息學(xué)和 CrcY 的生物信息學(xué)分析old algorithm (http: rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi)分別預(yù)測了C款在線軟件針對一條序列會給出多個預(yù)測結(jié)果，它們具有不同的自由最低和出現(xiàn)頻率最高的結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果。運用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫Uniprot檢索及氨基酸序列并使用 DNAMAN 將其與 A1501 RNase E 進行比對。序列，為進一步研究其轉(zhuǎn)錄活性奠定基礎(chǔ)。在 NCBI 上檢索與 CrcZ 和ega7.0 軟件繪制出 CrcZ 和 CrcY 的系統(tǒng)進化樹。 和 CrcY 生物信息學(xué)分析 和 CrcY 系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建
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本文編號：2876203