黃酮類(lèi)化合物是一類(lèi)廣泛存在于植物中的次生代謝產(chǎn)物,對(duì)于植物的自身防御和生理調(diào)節(jié)具有重要的作用。黃酮類(lèi)化合物還具有抗氧化、抑菌消炎、抑制腫瘤細(xì)胞活性、抗HIV活性等功能,且毒性較小,藥用價(jià)值較高。種子植物中黃酮代謝途徑已研究的較為清楚。蕨類(lèi)是一類(lèi)黃酮含量較高的植物類(lèi)群,但其黃酮代謝途徑尚不清楚。CHS是黃酮合成途徑中的第一個(gè)關(guān)鍵酶,在植物黃酮代謝中發(fā)揮著重要作用。漫長(zhǎng)的進(jìn)化過(guò)程中,CHS基因在不同植物譜系中發(fā)生了不同程度的重復(fù)和分化,導(dǎo)致在多數(shù)植物基因組中出現(xiàn)由CHS基因分化形成的CHSlike基因,組成了查爾酮合成酶基因超家族(Chalcone synthase superfamily)。到目前為止已在種子、蕨類(lèi),苔蘚植物中分離到多種查爾酮合成酶超家族基因,但在蕨類(lèi)植物中查爾酮合成酶超家族基因的種類(lèi)及功能尚不明確。研究蕨類(lèi)植物中查爾酮合成酶超家族基因,對(duì)闡明黃酮代謝途徑的分子機(jī)制,揭示查爾酮合成酶超家族基因的功能及其演化均具有重要的科學(xué)意義。本研究以紅蓋鱗毛蕨為實(shí)驗(yàn)材料,應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、PCR及高效液相色譜技術(shù)對(duì)查爾酮合成酶超家族基因進(jìn)行克隆、表達(dá)分析及功能研究,并對(duì)該基因序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果主要有以下幾個(gè)方面:1.利用Ilumina Hiseq 2000平臺(tái)對(duì)紅蓋鱗毛蕨拳卷葉進(jìn)行測(cè)序,獲得8.5G數(shù)據(jù)量。對(duì)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝拼接,共獲得Unigene 143604條。依據(jù)注釋結(jié)果分析獲得CHS可能性基因28條,經(jīng)分析選取其中4條作為CHS的候選基因。2.根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù),成功克隆到四條CHS候選基因的ORF序列,將該四條基因序列重新命名為:DeCHS、DeCHSlike1、DeCHSlike2和DeCHSlike3。生物信息學(xué)分析表明,DeCHS的ORF全長(zhǎng)1212bp,編碼403個(gè)氨基酸;DeCHSlike1的ORF全長(zhǎng)1371bp,編碼456個(gè)氨基酸;DeCHSlike2的ORF全長(zhǎng)1506bp,編碼501個(gè)氨基酸;DeCHSlike3的ORF全長(zhǎng)1332bp,編碼443個(gè)氨基酸。3.運(yùn)用In-fusion連接技術(shù),成功構(gòu)建四條CHS的重組質(zhì)粒pET28aDeCHS、pET28a-DeCHSlike1、pET32a-DeCHSlike2、pET32a-DeCHSlike3。將重組質(zhì)粒導(dǎo)入到BL21感受態(tài)細(xì)胞中構(gòu)建原核表達(dá)載體,并用IPTG誘導(dǎo)獲得融合蛋白,經(jīng)SDS-PAGE鑒定獲得蛋白大小分別為44.2KD、48.3 kDa、68.5 kDa、64.6 kDa,與預(yù)期的蛋白大小相一致。4.本研究以丙二酰CoA、香豆酰CoA、苯乙酰CoA、乙酰CoA和異戊酰CoA為底物,分別采用四條基因表達(dá)的融合蛋白對(duì)底物進(jìn)行催化,對(duì)催化產(chǎn)物進(jìn)行高效液相色譜(HPLC)檢測(cè),結(jié)果表明:DeCHS蛋白既能催化香豆酰CoA和丙二酰CoA反應(yīng)也能催化苯乙酰CoA和丙二酰CoA反應(yīng)產(chǎn)生柚皮素,和已報(bào)道的植物CHS基因功能一致。DeCHSlike1蛋白可催化香豆酰CoA和丙二酰CoA反應(yīng)產(chǎn)生柚皮素,但不能催化苯乙酰CoA和丙二酰CoA反應(yīng)。在以乙酰CoA、異戊酰CoA和丙二酰CoA反應(yīng)時(shí)均能產(chǎn)生產(chǎn)物,但產(chǎn)物未知。DeCHSlike2、DeCHSlike3蛋白可催化香豆酰CoA、苯乙酰CoA和丙二酰Co A反應(yīng)產(chǎn)生柚皮素;也可催化異戊酰CoA和丙二酰CoA反應(yīng)產(chǎn)生6-異丁基-4-羥基-2-吡喃酮,但以乙酰CoA和丙二酰CoA作為底物時(shí),產(chǎn)物不同,因此二者在功能上存在差異,需要進(jìn)一步探究。本研究發(fā)現(xiàn)紅蓋鱗毛蕨具有不同類(lèi)型的CHS基因,但其功能尚未產(chǎn)生明顯的分化。經(jīng)分析DeCHS與已報(bào)道的植物CHS基因功能相同;DeCHSlike1既具有CHS基因功能也具有CHSlike基因的功能;DeCHSlike2、DeCHSlike3可催化異戊酰CoA和丙二酰CoA反應(yīng)產(chǎn)生中間產(chǎn)物6-異丁基-4-羥基-2-吡喃酮,具有VPS的功能,表明DeCHSlike2和DeCHSlike3均為CHSlike類(lèi)型。綜上所述,紅蓋鱗毛蕨中具有查爾酮合成酶超家族基因。
【學(xué)位單位】：上海師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：Q943.2
【部分圖文】：

圖 1-1 黃酮類(lèi)化合物基本結(jié)構(gòu)ure 1-1 The elementary structure of flav化程度、苯環(huán)的連接位置以及分為六大類(lèi)（圖 1-2）：黃酮類(lèi)類(lèi)（flavanones）、黃酮醇類(lèi)（

圖 1-2 主要的黃酮類(lèi)化合物的結(jié)構(gòu)圖Figure 1-2 Structures of major classes of flavonoids化合物具有多種生物功能，如參與防御、紫外線防護(hù)、抑制作用、花著色和參與生殖過(guò)程等作用[49-51]。同時(shí)，黃酮類(lèi)化

圖 1-3 黃酮類(lèi)化合物的生物合成路線[55]Figure 1-3 A schematic presentation of the flavonoids biosynthetic pathway[55]1.2.3 黃酮合成途徑中的關(guān)鍵酶基因研究進(jìn)展
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2875272