黑毛雪兔子(Saussurea hypsipeta Diels),屬菊科(Compositae)風毛菊屬(Saussurea DC.),是一種生長于青藏高原地區(qū)的珍稀、瀕危藥用植物。同時,它又是一種典型的高山植物。植株密被表皮毛是黑毛雪兔子最具有代表性的形態(tài)特征,并且是黑毛雪兔子對極端環(huán)境適應的一種特殊結構。研究黑毛雪兔子表皮毛的形成和發(fā)育過程,對揭示高山植物適應環(huán)境的特殊機制將具有重要的理論意義。為此,本研究以黑毛雪兔子作為實驗材料,在建立起黑毛雪兔子離體再生體系的基礎上,通過RT-PCR,結合RACE技術,克隆了與表皮毛發(fā)育相關的基因TTG1,并研究了該基因的功能。主要研究結果如下:1.以野生苗葉片為外植體,通過愈傷組織途徑建立了植株再生體系。以MS為基本培養(yǎng)基,附加2.0 mg·L~(-1) 2,4-D和0.5 mg·L~-11 6-BA,適于愈傷組織的誘導;愈傷組織在含有0.5 mg·L~(-1) 2,4-D的MS培養(yǎng)基上繼代后,在附加1.0 mg·L~(-1) 6-BA和0.2 mg·L~(-1) NAA的MS培養(yǎng)基上,愈傷組織分化率為84.45%;在附加0.2mg·L~(-1) IAA和0.2%活性炭的1/2 MS培養(yǎng)基上,再生芽的生根率為82.2%;再生植株移栽到盆土中,大約有16.7%的苗存活,并能夠正常的生長。以再生苗葉片為外植體,通過不定芽的直接誘導建立了植株再生體系。以MS為基本培養(yǎng)基,附加0.5 mg·L~(-1) 6-BA和0.5 mg·L~(-1) NAA,適于葉片不定芽的直接誘導,平均每個外植體產(chǎn)生4.7個不定芽。2.克隆得到黑毛雪兔子TTG1基因。TTG1基因cDNA全長1378 bp,包含1014 bp的開放閱讀框,118 bp的5’端非編碼區(qū),225 bp的3’端非編碼區(qū)和21bp的ploy(A)尾巴。該基因共編碼337個氨基酸殘基,分子量為37.47 kDa,等電點4.82。同源比對顯示,推導出來的氨基酸序列與同一屬植物水母雪蓮(Saussurea medusa)的同源性為95.25%,與擬南芥(Arabidopsis thaliana)、煙草(Nicotiana tabacum)、黃瓜(Cucumis sativus)的同源性分別為73.91%、73.33%和74.78%。黑毛雪兔子TTG1基因的氨基酸序列有5個WD40 repeat,說明該基因可能編碼一種WD40蛋白,將該基因命名為ShTTG1(MF805763)。同時,克隆得到黑毛雪兔子ShTTG1基因的一對等位基因,命名為ShTTG1a(MG564780)和ShTTG1b(MG564781),基因長度均為1328 bp,CDS區(qū)為1014bp,編碼337個氨基酸;等位基因之間有3個核苷酸差異位點,在CDS區(qū)有1個差異位點,導致所編碼的多肽序列在250位點上的氨基酸存在差異,ShTTG1a為亮氨酸,ShTTG1b為甲硫氨酸。3.采用qRT-PCR技術,檢測黑毛雪兔子5個內(nèi)參基因(Actin、18S rRNA、GAPDH、EF1α和TUA)在不同組織中,以及低溫脅迫(4℃)和紫外脅迫處理下葉組織中的表達情況。在Delta Ct、geNorm、Best Keeper和Norm Finder軟件分析的基礎上,利用Ref Finder在線工具綜合分析5個內(nèi)參基因的穩(wěn)定性。結果表明,在不同組織中表達最穩(wěn)定的是GAPDH;在低溫脅迫下表達最穩(wěn)定的是18S rRNA;在紫外脅迫下表達最穩(wěn)定的是Actin。為黑毛雪兔子相關基因的表達研究提供了較穩(wěn)定的內(nèi)參基因。以GAPDH作為內(nèi)參基因,檢測ShTTG1基因在黑毛雪兔子根、莖、葉和花中的表達情況。結果表明,ShTTG1基因在4種組織中都有表達,其中在葉中的表達量最高。將ShTTG1基因連接到pColdⅠDNA表達載體,構建了原核表達載體pColdⅠDNA::ShTTG1,并導入到BL21(DE3)大腸桿菌中進行原核表達,表達產(chǎn)物用SDS-PAGE電泳分析。結果表明,目的蛋白在大腸桿菌中表達,表達蛋白的分子量接近40 kDa,與預測的融合蛋白分子量大小相符。4.構建了ShTTG1基因的超表達載體35S::ShTTG1,在根癌農(nóng)桿菌介導下,將目的基因ShTTG1轉入本氏煙草(Nicotiana benthamiana)中。通過PCR和RT-PCR檢測,獲得3株轉基因煙草植株。形態(tài)學比較表明,轉基因植株葉柄和葉片上的表皮毛較長,且在表皮毛密度上與對照有顯著差異。構建了ShTTG1基因的亞細胞定位載體35S::ShTTG1-GFP。共聚焦結果顯示,ShTTG1蛋白定位于細胞核中,這符合轉錄因子的特征。將35S::ShTTG1-GFP載體轉化本氏煙草。在轉基因煙草葉片中,除了葉脈外,表皮毛中也有較強的熒光信號,推測ShTTG1基因與表皮毛發(fā)育有關。對黑毛雪兔子進行了紫外和低溫脅迫處理。結果表明,在紫外處理下,ShTTG1基因的表達量在3 h后顯著提高,之后下降。而在低溫處理下,ShTTG1基因的表達量與對照組差異不顯著,推測黑毛雪兔子的表皮毛可能是針對紫外輻射的一種適應結構。
【學位單位】：青海大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：S567.239
【部分圖文】：

、細胞分化、細胞周期調控等過程[17]。由于擬南芥表皮毛結構特殊，屬，并廣泛分布于花瓣、莖、莖生葉和蓮座葉上，有利于細胞生命周期，發(fā)生，起源和發(fā)育的研究。（1）擬南芥表皮毛的形態(tài)發(fā)育擬南芥表皮毛在發(fā)育初期有絲分裂活動停止，特定的表皮毛細胞開始膨變大，細胞核開始復制（圖 1.1A1）；經(jīng)過 3 次核內(nèi)復制，其 DNA 含量長[18]；隨著植物表皮毛的發(fā)育，表皮毛主干結構逐漸形成，原表皮細胞膨向外延伸（圖 1.1 A2）；垂直凸起的頂端細胞，圍繞凸起頂點開始形成支（圖 1.1 A3）；表皮毛頂端形成凸起后，細胞整體增大，細胞核進行，細胞接著進行彌散性生長，大多數(shù)表皮細胞最終形成 3 個分支（圖 1.1A；伸長階段鈍狀的表皮形成分支，并沿著整個細胞軸線延伸，隨著分支的逐漸變尖（圖 1.1B5）[20]；表皮細胞形成完整的表皮毛后，在表皮毛表數(shù)量不等的玻璃狀乳突，并有起支撐作用的表皮細胞圍繞在成熟表皮毛部（圖 1.1 B6）[21]。

毛的發(fā)生[44]。GL1 和 TTG1 的等位基因之間的互作，不但能夠產(chǎn)生發(fā)育不完全的表皮毛簇，還會出現(xiàn)非特異性表皮毛簇的增加[45]。這些都說明，TTG1 和 GL1 都能限制表皮毛的啟動，并且 TTG1 和 GL1 作為復合體共同發(fā)揮作用。綜上所述，TTG1 和 GL1 基因在表皮毛發(fā)育調控中進行平衡調節(jié)，控制表皮毛啟動與限制表皮毛發(fā)生。TRY 蛋白能夠與 GL1 和 TTG1 互作，來改變 GL1 和 TTG1 復合體的活性，并影響表皮毛發(fā)育啟動活性。研究發(fā)現(xiàn)，TRY 主要介導早期表皮毛周邊細胞的側向抑制，在 TRY 突變體中，約 5%～10%的表皮毛成簇存在，現(xiàn)已有實驗證明 TRY 主要功能是側向抑制[46]。在 CPC 轉錄因子研究中發(fā)現(xiàn)，CPC 轉錄因子功能與 TRY 相同，在過表達試驗中 CPC 基因抑制了擬南芥表皮毛的發(fā)生，推測 CPC 基因屬于負調節(jié)基因[47]。在互作實驗中發(fā)現(xiàn)，GL2 能夠調控根毛表皮細胞的發(fā)育，在此過程中受 MYB-bHLH-TTG1 復合體的影響。（3）擬南芥表皮毛分化的調控模型目前，在擬南芥中有兩種表皮毛發(fā)育模型在共同發(fā)揮作用，即激活抑制模型（Activator-Inhibitor Model）和激活消耗模型（Activator-Depletion Model）。

（圖 1.2）[48]。近幾年的相關研究闡明，GL1 和 TTG1 都能夠與 bHLH 轉錄因子類基因 GL3、EGL3 相互作用，并形成 MYB-bHLH-WD40 蛋白復合物，正向調控表皮毛起始；隨著表皮毛起始復合物 MYB-bHLH-WD40 的積累，達到一定量時，就能夠激活 GL2 的表達，促進表皮毛形成。由于 GL2 屬于含有 HD-Zip 結構的轉錄因子，作為表皮毛的正向調控因子，在表皮毛形成中發(fā)揮重要的作用[48][50]。
【相似文獻】

相關期刊論文 前1條

1 霍建青;;青海省海北州菊科風毛菊屬植物種類的開發(fā)利用[J];畜牧與飼料科學;2012年09期

相關博士學位論文 前1條

1 史國民;黑毛雪兔子表皮毛發(fā)育相關基因ShTTG1的克隆及功能研究[D];青海大學;2018年

本文編號：2874293