在動植物中' DNA和組蛋白的甲基化修飾能夠調節(jié)異染色質的形成和轉錄水平的基因沉默。甲基轉移酶在催化甲基化修飾過程中需要S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)提供甲基。因此,維持動植物細胞內正常的SAM水平對表觀遺傳修飾的調控起著重要的作用,但其調控途徑和機理還需更加深入的研究。通過EMS誘變攜帶Pro35S::NPTⅡ(neomycin phosphotransferaseⅡ)和ProRD29A(responsive to desiccation 29 A)::LUC 的 L119 株系,篩選能夠釋放 Pro35S::NPTⅡ位點沉默的突變體,得到一個維持基因沉默的作用因子甲硫氨酸腺苷轉移酶4(methionine adenosyltransferase 4,MAT4)。本論文對其通過影響表觀遺傳修飾調控基因表達的機理進行了研究。MAT4能夠催化SAM的合成,而SAM是普遍的甲基供體,因此本論文首先對MAT4是否影響甲基化修飾進行分析。通過亞硫酸氫鹽測序發(fā)現(xiàn),與L119相比,mat4中CHG和CHH的DNA甲基化水平明顯下降。免疫印跡實驗證實mat4中組蛋白甲基化修飾H3K9me2的水平顯著降低。而進一步的免疫熒光實驗發(fā)現(xiàn)mat4中H3K9me2在細胞核中異染色質區(qū)的狀態(tài)變得松散。同時染色質免疫共沉淀實驗發(fā)現(xiàn)mat4中一些位點上H3K9me2的水平下降,這些結果說明MAT4參與維持DNA和組蛋白甲基化修飾過程。轉錄組測序分析發(fā)現(xiàn)mat4中很多轉座子的轉錄被激活,而這些轉錄發(fā)生上調的轉座子的DNA甲基化水平下降,說明MAT4通過維持DNA和組蛋白甲基化修飾參與轉錄水平的基因沉默。另外,外源施加一定濃度的SAM能夠部分恢復mat4的卡那霉素敏感表型及H3K9me2的水平,說明SAM是通過直接影響這些甲基化修飾來調節(jié)基因轉錄的。對擬南芥中MAT4所屬家族四個成員的研究發(fā)現(xiàn),MAT4對DNA甲基化的影響起主導作用。利用液相色譜和質譜聯(lián)用技術測定SAM水平,結果顯示,與L119相比,mat4中SAM水平下降了35%左右:而其他mat突變體中SAM水平下降程度較小。體外酶活測定發(fā)現(xiàn)MAT4的催化能力與MAT1和MAT2相當,而MAT3的活性略高一些,說明MAT4的主導作用并非其活性所致。將MAT4的啟動子驅動MAT1、MAT2、MAT3 CDS轉入mat4,可互補mat4的表型;而將MAT1、MAT2、MAT3啟動子驅動MAT4 CDS轉入mat4中,獲得的轉基因植株大多數(shù)不能恢復mat4的抗卡那霉素以及萌發(fā)遲緩的表型。進一步用不同MAT啟動子的材料檢測,發(fā)現(xiàn)用MAT4啟動子驅動的MAT轉錄水平以及MAT蛋白水平的豐度最高。因此,MAT4的表達模式可能使其在調控SAM水平上發(fā)揮更為重要的作用,進而在影響DNA和組蛋白甲基化修飾過程中起主導作用。遺傳分析發(fā)現(xiàn)mat1mat4雙突變體矮小敗育,而mat2mat4雙突變體是胚胎致死的。此外,通過CRISPR/Cas9敲除MAT4獲得的片段缺失突變體也是致死的,說明MAT4在擬南芥生長和胚胎發(fā)育中有重要作用。同時通過體外的Pull-Down實驗和體內的Co-IP實驗證明不同的MAT蛋白之間能夠相互作用,而分子篩實驗的結果進一步證明它們在大分子量的復合體中共同存在,說明在擬南芥中這四個MAT蛋白能夠形成多聚體發(fā)揮功能。綜合以上結果,本研究對擬南芥中一個新的維持基因沉默的作用因子MAT4進行了功能研究,揭示了其通過維持植物細胞內SAM濃度,調控DNA和組蛋白甲基化修飾,進而影響一些沉默位點轉錄的調控機理。這些發(fā)現(xiàn)對于闡明植物中代謝過程與表觀遺傳修飾過程之間的相互聯(lián)系具有重要的理論意義。
【學位單位】：中國農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：Q943.2
【部分圖文】：

精氨酸和天冬氨酸形成ＲＤ界面介導兩分子ＤＮＭＴ３Ａ蛋白的互作（圖卜１Ａ）。由此形成兩個活性??位點，這兩個活性位點被８－１０ｂｐ的一個ＤＮＡ螺旋分開，ＤＮＭＴ３Ａ催化ＤＮＡ甲基化的建立，產(chǎn)生??相隔８－１０?ｂｐ的兩個甲基化的ＣＧ位點（圖１－１Ｃ）?（Ｊｅｌｔｓｃｈ?ａｎｄ?Ｊｕｒｋｏｗｓｋａ＾?２０１３，?２０１６）。研宄表明??ＤＮＭＴ３Ａ具有寡聚化和多聚化的潛能：即在同一條ＤＮＡ鏈上可以結合上多個相鄰的??ＤＮＭＴ３Ａ－ＤＮＭＴ３Ｌ四聚體，因此可以看到在同一條ＤＮＡ鏈上存在相同間隔的ＣＧ甲基化修飾。??ＤＮＡ結合實驗及掃描電鏡也發(fā)現(xiàn)ＤＮＭＴ３Ａ－ＤＮＭＴ３Ｌ形成的多聚體可以結合多條ＤＮＡ鏈，從而??催化?ＤＮＡ?甲基化的建立（圖?１－１Ｂ，１Ｃ，?ＩＤ，?ＩＥ）?（Ｊｅｌｔｓｃｈ?ａｎｄ?Ｊｕｒｋｏｗｓｋａ，?２０１３，?２０１６）。另外?ＤＮＭＴ３Ａ??的催化活性受到自身及未發(fā)生甲基化的Ｈ３Ｋ４殘基調節(jié)。晶體結構解析發(fā)現(xiàn)ＤＮＭＴ３Ａ的ＡＤＤ結??構域能夠與自身的ＣＤ結構域（ｃａｔａｌｙｔｉｃ?ｄｏｍａｉｎ）結合，從而通過阻礙其與ＤＮＡ的結合抑制ＣＤ??結構域的催化活性。而未發(fā)生甲基化的組蛋白Ｈ３則能夠破壞ＡＤＤ－ＣＤ的結合，解除ＤＮＭＴ３Ａ??的自我抑制作用（Ｇｕｏ?ｅｔａｌ．

精氨酸和天冬氨酸形成ＲＤ界面介導兩分子ＤＮＭＴ３Ａ蛋白的互作（圖卜１Ａ）。由此形成兩個活性??位點，這兩個活性位點被８－１０ｂｐ的一個ＤＮＡ螺旋分開，ＤＮＭＴ３Ａ催化ＤＮＡ甲基化的建立，產(chǎn)生??相隔８－１０?ｂｐ的兩個甲基化的ＣＧ位點（圖１－１Ｃ）?（Ｊｅｌｔｓｃｈ?ａｎｄ?Ｊｕｒｋｏｗｓｋａ＾?２０１３，?２０１６）。研宄表明??ＤＮＭＴ３Ａ具有寡聚化和多聚化的潛能：即在同一條ＤＮＡ鏈上可以結合上多個相鄰的??ＤＮＭＴ３Ａ－ＤＮＭＴ３Ｌ四聚體，因此可以看到在同一條ＤＮＡ鏈上存在相同間隔的ＣＧ甲基化修飾。??ＤＮＡ結合實驗及掃描電鏡也發(fā)現(xiàn)ＤＮＭＴ３Ａ－ＤＮＭＴ３Ｌ形成的多聚體可以結合多條ＤＮＡ鏈，從而??催化?ＤＮＡ?甲基化的建立（圖?１－１Ｂ，１Ｃ，?ＩＤ，?ＩＥ）?（Ｊｅｌｔｓｃｈ?ａｎｄ?Ｊｕｒｋｏｗｓｋａ，?２０１３，?２０１６）。另外?ＤＮＭＴ３Ａ??的催化活性受到自身及未發(fā)生甲基化的Ｈ３Ｋ４殘基調節(jié)。晶體結構解析發(fā)現(xiàn)ＤＮＭＴ３Ａ的ＡＤＤ結??構域能夠與自身的ＣＤ結構域（ｃａｔａｌｙｔｉｃ?ｄｏｍａｉｎ）結合，從而通過阻礙其與ＤＮＡ的結合抑制ＣＤ??結構域的催化活性。而未發(fā)生甲基化的組蛋白Ｈ３則能夠破壞ＡＤＤ－ＣＤ的結合，解除ＤＮＭＴ３Ａ??的自我抑制作用（Ｇｕｏ?ｅｔａｌ．

甲基化的過程主要為：ＵＨＲＦ１的同源蛋白ＶＩＭ１／２／３?（Ｖａｒｉａｎｔ?Ｉｎ?Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ?１／２／３）通過其ＳＲＡ結??構域識別半甲基化的ＤＭＡ，ＭＥＴ１通過與Ｖ１Ｍ１／２／３相互作用從而被招募至靶位點，催化新合成的??ＤＮＡ鏈上的甲基化：完成ＤＮＡ甲基化的維持過程（圖１－４Ｃ）?（Ｋｉｍ?ｅｔ?ａＬ，?２０１４；?Ｗｅｎｄｔｅ?ａｎｄ?Ｓｃｈｍｉｔｚ，??２０１８；?Ｗｏｏ?ｅｔ?ａｌ．，２００８）。研宄發(fā)現(xiàn)ＶＩＭ蛋白在維持ＤＮＡ甲基化的過程中存在功能冗余，Ｗｗｉ、ｗ＇ｗ２??或咖＾單突變體中ＤＮＡ甲基化水平并無顯著變化，但是ｖ／ｗ２?ｖ／ｗＪ三突變體中ＣＧ甲基化??水平非常低（Ｓｔｒｏｕｄ?ｅｔ?ａｌ．，?２０１３）。另外有研宄發(fā)現(xiàn)有些位點上ＣＧ甲基化的維持需要去乙�；�??ＨＤＡ６?（ｈｉｓｔｏｎｅ?ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ?６）的參與，它能夠與ＭＥＴ１相互作用從而輔助該類位點進行ＣＧ甲基化??的維持（Ｂｌｅｖｉｎｓ?ｅｔａｌ．，?２０１４；?Ｗｅｎｄｔｅ?ａｎｄ?Ｓｃｈｍｉｔｚ，?２０１８）。ＤＮＡ甲基化的維持需要染色質重塑因子??ＤＤＭｌ（Ｄｅｃｒｅａｓｅｉｒ＾ＤＮＡＭｅｔｈｙ丨ａｔｉｏｎｌ）的參與，ｃＷｗＪ中定位于異染色質區(qū)的一些轉座子的ＣＧ甲??基化水平下降非常明顯，因此ＤＤＭ１可能主要調控異染色質區(qū)的染色質環(huán)境從而利于ＤＮＡ甲基??轉移酶ＭＥＴ１催化異染色質區(qū)一些轉座子位點上ＣＧ的甲基化（Ｊｅｄｄｅｌｏｈ?ｅｔ?ａｌ．
【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 Hsuan Yu Kuo;Elise L.Jacobsen;Yanping Long;Xinyuan Chen;Jixian Zhai;;Characteristics and processing of Pol Ⅳ-dependent transcripts in Arabidopsis[J];Journal of Genetics and Genomics;2017年01期

2 Natalia A Osna;Wayne G Carter;Murali Ganesan;Irina A Kirpich;Craig J Mc Clain;Dennis R Petersen;Colin T Shearn;Maria L Tomasi;Kusum K Kharbanda;;Aberrant post-translational protein modifications in the pathogenesis of alcohol-induced liver injury[J];World Journal of Gastroenterology;2016年27期

本文編號：2859236