月季(Rosa hybrida)作為全球的切花貿(mào)易中重要的切花之一,在產(chǎn)地蕾期采收,經(jīng)過運輸?shù)较M者手中重新瓶插開放的過程中,往往經(jīng)歷典型的可逆失水脅迫。然而,月季切花可逆失水脅迫耐性的調(diào)節(jié)機制仍不清楚。鐵蛋白是植物中普遍存在的一類多亞基球形蛋白,可以貯存細(xì)胞中的自由Fe2+離子,廣泛參與植物的生長發(fā)育過程以及生物和非生物脅迫的響應(yīng)。本研究在前期月季失水cDNA文庫中,篩選出了一個快速響應(yīng)可逆失水脅迫的鐵蛋白(Ferritin)基因JK616449,但是其功能還是不清楚的。本課題通過酵母單雜、qRT-PCR和VIGS等方法對Ferritin的基本生化特性、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、生物學(xué)功能等進行了探究,結(jié)果如下:1)克隆了 JK616449基因的全長1518bp,編碼區(qū)為807bp編碼了一個含268個氨基酸的蛋白,具有植物鐵蛋白特有的多肽延長鏈(EP)和保守的Fe儲存和轉(zhuǎn)移序列。進化樹分析表明,JK616449與AtFer1同源性最高,重命名為RhFer1。ABA和失水脅迫能夠誘導(dǎo)RhFer1的表達。2)失水脅迫能夠誘導(dǎo)月季花瓣Fe的總濃度升高,但游離Fe2+濃度維持不變。qRT-PCR結(jié)果表明,失水脅迫能夠抑制Fe運輸基因的表達。在可逆失水脅迫處理的花瓣中,Fe主要定位于細(xì)胞質(zhì)和維管束,而不是液泡和質(zhì)外體。此外,過氧化氫的含量和活性氧清除酶的活性也沒有發(fā)生明顯的變化。這些結(jié)果表明,月季花瓣可逆失水脅迫過程中,Fe平衡的維持不依賴Fe運輸機制。3)沉默RhFer1降低了月季花瓣的失水脅迫耐性。花瓣中沉默RhFer1后,總的Fe濃度不變,游離Fe2+的濃度增加,過氧化氫和活性氧清除酶的活性明顯升高。結(jié)果表明,沉默RhFer1使花瓣遭受了嚴(yán)重的Fe誘導(dǎo)的氧化脅迫,降低了花瓣的恢復(fù)能力。4)失水脅迫過程中RhFer1轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)是依賴RhABF2的。沉默RhABF2下調(diào)RhFer1的表達。EMSA體外試驗證明,RhABF2能夠與含有ABRE元件的RhFer1啟動子探針結(jié)合。酵母單雜和瞬時轉(zhuǎn)化煙草的體內(nèi)試驗表明,RhABF2能夠直接靶定到RhFer1啟動子上的ABRE元件,并激活報告基因的表達。5)沉默RhABF2降低了花瓣的失水脅迫耐性。在失水脅迫的花瓣中,沉默RhABF2導(dǎo)致更高的游離Fez+濃度,打破了 Fe平衡,積累了過氧化氫,使花瓣遭受了嚴(yán)重的氧化脅迫,降低了花瓣失水脅迫耐性。6)在月季花瓣自然衰老的過程中,ABA逐漸積累,RhABF2、RhFer1和Fe運輸相關(guān)的基因的表達上升。沉默RhABF2和RhFer1打破Fe平衡,加速了花瓣衰老。這些結(jié)果表明,在衰老過程中,RhABF2/RhFer1調(diào)節(jié)模塊與Fe運輸基因,協(xié)同參與了花瓣的衰老進程�？傊�,在可逆的失水脅迫過程中,月季花瓣主要是通過RhABF2/RhFer1調(diào)節(jié)模塊而不是Fe運輸基因,調(diào)節(jié)失水誘導(dǎo)的游離Fe2+的水平,緩解氧化脅迫提高失水脅迫耐性。而在花瓣衰老的過程中,RhABF2/RhFer1調(diào)節(jié)模塊又能與Fe運輸基因協(xié)同調(diào)節(jié)Fe的回收再利用,參與花瓣的衰老進程。
【學(xué)位單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S685.12
【部分圖文】：

２００１）。體內(nèi)平衡的信號能夠負(fù)調(diào)控解毒作用信號，這是由于細(xì)胞體內(nèi)平衡的重新建立減少了損??傷對解毒信號的誘導(dǎo)作用。細(xì)胞體內(nèi)平衡的再建立和解毒信號，共同調(diào)節(jié)了植物對失水脅迫的耐??性，影響了植物的生長（圖１－２）。??離子平衡是細(xì)胞體內(nèi)平衡的重要組成部分，重建離子平衡能夠提高植物對于脅迫的耐性。例??如當(dāng)植物遭受干旱脅迫時，ＳＯＳ相關(guān)的基因能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ｎａ＋的平衡，并刺激Ｃａ２＋信號途徑，??調(diào)節(jié)細(xì)胞對脅迫的響應(yīng)（Ｚｈｕ，２０００）。其他一些金屬離子如Ｃｕ２＋、Ｆｅ２＋、Ｚｎ２＋等，在細(xì)胞的新陳代??謝中也起著重要的功能。當(dāng)離子濃度低于正常水平時，就會打破原生質(zhì)體內(nèi)的平衡，阻礙正常的??新陳代謝。相反的，離子濃度過高時，又會產(chǎn)生毒性對細(xì)胞造成損傷，影響細(xì)胞的完整性降低植??物的脅迫耐性（Ｂｉｒｄ?ｅｋ／．，?２０１５）。因此，重建離子平衡是提高植物對脅迫的耐性的重要因素之一。??離子的再平衡也能夠影響細(xì)胞的滲透平衡，進一步影響了細(xì)胞的膨壓，提高植物的失水脅迫耐性。??失水脅迫還能夠激活解毒系統(tǒng)（Ｒｅｇｕｅｒａｄ？／．

礎(chǔ)的生化反應(yīng)中。例如硫的同化、氮的固定以及ＤＮＡ的合成和修復(fù)等（Ｒａｖｅｔ?ｅｆａ／．，２００９）。由于??Ｆｅ的不穩(wěn)定性，植物細(xì)胞積累Ｆｅ到過量的水平時，非必需的Ｆｅ２＋離子會通過芬頓反應(yīng)催化產(chǎn)生??活性氧，對細(xì)胞造成損傷（圖１－３，?Ｖａｌｋｏｅｆａ／．，２００５）。因此，Ｆｅ的平衡是影響植物正常生長的??重要因素之一。由于植物不能移動，所以它們高度依賴環(huán)境。植物己經(jīng)進化出了精細(xì)的內(nèi)在調(diào)節(jié)??機制，控制其體內(nèi)的Ｆｅ平衡，保證正常的生長。植物Ｆｅ平衡的調(diào)控主要包括Ｆｅ的吸收、運輸??和儲存。植物經(jīng)過根的作用，將Ｆｅ從土壤中吸收到根的表皮細(xì)胞中，然后經(jīng)過質(zhì)外體等途徑運??輸至各個組織和器官中。植物中Ｆｅ主要儲存在質(zhì)外體、細(xì)胞膜、細(xì)胞壁以及液泡中以及鐵蛋白??中（Ｂｒｉａｔ?ｅｆ?ａ／．，１９９９）。??Ｆｅ３＋?＋?０２－?—？?Ｆｅ２＋?＋?０２??Ｆｅ２＋?＋?Ｈ２〇２?—?Ｆｅ３＋?＋?ＯＨ－?＋?ＯＨ??Ｓｕｍｍａｒｉｚｅｄ?：?Ｏｊ－?＋?Ｈ２Ｏ２?＾?〇２?＋?〇Ｈ￣?＋?ＯＨ＇??圖１－３芬頓反應(yīng)過程（Ｖａｌｋｏｅｆａ／．，２００５）??Ｆｉｇｕｒｅ?１－３．?Ｆｅｎｔｏｎ?ｒｅａｃｔｉｏｎ??１．３．２植物對缺Ｆｅ脅迫的調(diào)節(jié)機制??自然界中的Ｆｅ極易被氧化，并主要以不溶的氧化態(tài)存在。由于Ｆｅ的這個特性，在土壤中可??溶性的Ｆｅ的含量，往往低于植物所需要的水平。因此，植物進化出Ｆｅ吸收的機制，來維持植物??的正常的生長和發(fā)育。目前已經(jīng)證明

標(biāo)準(zhǔn)開花級數(shù)２級時采收。采收后基部插入自來水中，然后轉(zhuǎn)移到實驗室。將月季花枝在水中進??行修剪，保留莖桿長度約３０?ｃｍ，以及２片復(fù)葉，最后將基部插入去離子水中，平衡２?ｈ后備用。??開花級數(shù)參考Ｍａ?（２００５）的分級標(biāo)準(zhǔn)，將月季的開放程度分為下面７個級數(shù)（圖２－１）。??ＩＩＨＳ??圖２－１月季花朵開放級數(shù)（Ｍａｒｔ?ａ／．，?２００５）??Ｆｉｇｕｒｅ?２－１?Ｒｏｓｅ?ｆｌｏｗｅｒ?ｏｐｅｎｉｎｇ?ｓｔａｇｅｓ??２．１．２試驗材料的處理??２．１．２．１失水脅迫處理??２．１．２．１．１花瓣的失水脅迫處理??在體的月季花瓣：開花級數(shù)為２級的月季花材，取自昌平南口農(nóng)場溫室，運輸至實驗室后經(jīng)??修剪平衡后，放置在瓶插室（溫度２５°Ｃ，濕度４０％－５０％）進行失水脅迫，經(jīng)過失水０、１、３、６、??１２、２４?ｈ后取下花枝上的花瓣拍照，測量鮮重并取樣，樣本保存于－８０°Ｃ冰箱。??離體的月季花瓣：將平衡修剪的２級花材的花瓣取下，花瓣內(nèi)側(cè)面朝上放置于瓶插室（溫度??２５°Ｃ，濕度４０％－５０％）進行失水脅迫，注意不要損傷花瓣，經(jīng)過失水０、１、３、６、１２、２４ｈ后??拍照，測量鮮重并取樣，樣本保存于－８０°Ｃ冰箱。??１４??
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1 劉計濤;月季鐵蛋白基因RhFer1參與花瓣失水脅迫耐性和衰老進程的功能分析[D];中國農(nóng)業(yè)大學(xué);2018年

本文編號：2846456