菘藍(lán)(Isatis indigotica Fort.)是十字花科(Cruciferae)菘藍(lán)屬(Isatis)兩年生草本植物,其干燥的根和葉入藥分別稱為板藍(lán)根和大青葉。IAA作為內(nèi)源生長激素,在植物的生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用,YUCCA家族基因是IAA吲哚-3-丙酮酸(IPA)合成途徑中的關(guān)鍵限速酶基因。目前,尚無菘藍(lán)YUCCA家族基因的研究報(bào)道。本研究基于菘藍(lán)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)信息,從10個(gè)候選內(nèi)參基因中,篩選出適宜于不同研究條件的最適內(nèi)參基因;并進(jìn)一步運(yùn)用qRT-PCR技術(shù)探究了菘藍(lán)YUCCA基因家族成員的表達(dá)模式;最后,對IiYUCCA6基因進(jìn)行克隆和生物信息學(xué)分析,并構(gòu)建相應(yīng)的亞細(xì)胞定位載體、原核表達(dá)載體和過表達(dá)載體,對其功能進(jìn)行了初步研究。本研究所得主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:(1)基于geNorm和NormFinder分析結(jié)果,從10個(gè)候選基因中確定了在菘藍(lán)不同發(fā)育階段、不同組織部位和不同非生物脅迫條件下適用于qRT-PCR技術(shù)的最適內(nèi)參基因分別為IiPP2A-4,IieIF2和IiRPL15。(2)對菘藍(lán) YUCCA 基因家族成員(IiYUCCA2、IiYUCCA5、IiYUCCA6 和IiYUCCA8)在不同組織部位、不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)情況進(jìn)行了研究,結(jié)果表明:對于不同組織部位而言,IiYUCCA5基因在根中表達(dá)水平最高,而liYUCCA2、IiYUCCA6和IiYUCCA8則在老莖和老葉中的表達(dá)具有明顯優(yōu)勢;對于不同發(fā)育時(shí)期而言,LiYUCCA6在花期的表達(dá)水平最高,IiYUCCA2、IiYUCCA5和IiYUCCA8在幼苗期的表達(dá)水平高于其他發(fā)育階段。(3)對菘藍(lán) YUCCA 基因家族成員(IiYYUCCA2、IiYUCCA5、IiYUCCA6 和IiYUCCA8)在不同非生物脅迫誘導(dǎo)條件下的表達(dá)情況進(jìn)行了研究,結(jié)果表明:干旱能夠有效誘導(dǎo)IiYUCCA6和IiYUCCA8的高表達(dá),并在一定程度上抑制IiYUCCA2和IiYUCCA5的表達(dá)。鹽脅迫對IiYUCCA5基因的表達(dá)呈現(xiàn)初期抑制,后期促進(jìn)的影響,而對IiYUCCA2、IiYUCCA6和IiYUCCA8則具有良好的促進(jìn)作用。低溫誘導(dǎo)IiYUCCA8基因的高表達(dá),而對IiYUCCA2、IiYUCCA5和IiYUCCA6的表達(dá)則呈現(xiàn)前期抑制后期促進(jìn)的影響作用。傷害處理對IiYUCCA2、IiYUCCA5、IiYUCCA6和IiYUCCA8表達(dá)的影響作用較為一致,均表現(xiàn)為前期抑制,后期促進(jìn)。(4)對菘藍(lán)IiTYUCCA6基因(Genbank登錄號:KY318462.1)進(jìn)行了克隆和生物信息學(xué)分析,結(jié)果表明:該基因的ORF區(qū)全長為1,335 bp,編碼444個(gè)氨基酸;分子量為49.78 kDa,等電點(diǎn)為8.71,無跨膜結(jié)構(gòu)域,無信號肽,屬親水性蛋白,包含F(xiàn)MO黃素單加氧酶的所有保守基序,可能定位于細(xì)胞質(zhì)中。進(jìn)一步通過多序列比對以及系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn),IiYUCCA6基因的氨基酸序列與十字花科植物蘿卜(Raphanus sativus)的親緣關(guān)系最近。(5)構(gòu)建IiYUCCA6亞細(xì)胞定位載體,運(yùn)用根癌農(nóng)桿菌GV3101介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法浸染洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞,熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示,該基因表達(dá)的蛋白主要分布于細(xì)胞質(zhì)中,而在細(xì)胞核中也有少量分布。(6)構(gòu)建IiYUCCA6基因原核表達(dá)載體,并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),探究其在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)的最優(yōu)條件。結(jié)果顯示:該融合蛋白表達(dá)的最佳條件為0.5 mMIPTG,37 ℃下誘導(dǎo)3 h,且主要以包涵體的形式進(jìn)行表達(dá)。(7)構(gòu)建IiYUCCA6基因過表達(dá)載體,并轉(zhuǎn)化煙草,共獲得10個(gè)陽性轉(zhuǎn)基因株系。其中,目的基因表達(dá)量最高的兩個(gè)陽性株系3和9,其表型呈現(xiàn)株高增加、頂端優(yōu)勢明顯等高生長素表型,且IAA含量也有所升高,分別達(dá)到對照的1.20和1.19倍;進(jìn)一步對這兩個(gè)株系中生長素響應(yīng)基因的表達(dá)水平進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示NtIAA8、NtIAA16、NtGH3.1和NtGH3.6相對于對照組表達(dá)水平均有顯著性升高,分別達(dá)到對照的2.7、15.2、8.0、59.6倍和6.5、26.9、3.7、42.0倍;同時(shí),對這兩個(gè)陽性株系進(jìn)行黑暗脅迫處理后發(fā)現(xiàn),處理7 d后,相對于對照組,葉綠素含量下降比例顯著性降低、H202含量增加值顯著性減少。此外,黑暗處理7 d后,衰老相關(guān)基因NtSAG12的表達(dá)水平也顯著降低。因此,IiYUC,CA6基因在煙草中異源表達(dá),能夠有效延緩植物在黑暗條件下的衰老進(jìn)程,表現(xiàn)出一定程度的抗逆性。
【學(xué)位單位】：陜西師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S567.239
【部分圖文】：

Ｆｉｇ．?２－１?Ｔｈｅ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｒｅｓｕｌｔ?ｏｆ?１０?ｃａｎｄｉｄａｔｅ?ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ?ｇｅｎｅｓ??以菘藍(lán)葉片的第一鏈ｃＤＮＡ為模板，分別以１０個(gè)候選內(nèi)參基因的ｑＲＴ－ＰＣＲ??引物進(jìn)行實(shí)時(shí)定量ＰＣＲ擴(kuò)增，所得熔解曲線如圖（圖２－２），結(jié)果顯示所有基因??的擴(kuò)增曲線均呈現(xiàn)單峰，表明引物的特異性較好。??ｆｌＷｉ?ｔ－ｉｒ．?Ａ?６ＷＳ?ｍｃｔ－?Ａ??ｓ：?八?，：?八??，？＊１Ｃ?Ｊ?＼?／?＼??�！叮�?Ｊ?＼?〇？〇？???Ｊ?＼??０?９Ｃ０???０?０００?＾?—??ｍｏｃ?ｒｔａｔ?ｎＭ?ｎｏ？?？：〇？?ｍｍ?ｎｏｔ?ｍｃｏ?ｍｓｏ?ｍｍ?ｍｄｃｍｃｏ?？ｚｏｅ?＊ｓｅｅ?ｎ＜ｃ?ｓ：？ｏ?＊？ｏｅ?ｒｅｅ?？：〇？?ｍｍ?ｍｏｏ??ｉ廣?八?Ａ???Ｊ?＼?，：???Ｊ?＼??■???ｅｏｏｔ?＾???ｅ？〇ｅ?Ｍｅｏ?ｔｊｏｏ?ｒｊａｃ?ｙ￥ｃｅ?ｎｏｃ?ｍｍ?？７〇？?？？？ｃ?ｓｊ？?ｕｔｔ?ｈｂｏ?ｔｊｋ?ｎａａ?ｎｓｔ－?＊ｓｗ?ｍｏｏ?ｐ．ｓｏ?ｍｃｏ?ｎｏｏ?？ｅｏｃ??Ｔｍｅｎｒｎｍ??ｔ８２ｊ?八?ｅｏｎ??

．－．，。??表２－２?１０個(gè)候選內(nèi)參基因的引物擴(kuò)增效率???Ｔａｂｌｅ?２－２?Ｔｈｅ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ?ｏｆ?１０?ｃａｎｄｉｄａｔｅ?ｇｅｎｅｓ?ｉｎ?Ｉｓａｔｉｓ?ｉｎｄｉｇｏｔｉｃａ?Ｆｏｒｔ．?Ｇｅｎｅ?ａｂｂｒｅｖｉａｔｉｏｎ??Ｅ?（％）ＩｉｅＩＦ２?０．９５８３?１．２０??ＩｉＡＣＴ７?０．９８２９?１．１５??ＨＰＰ２Ａ－４?０．９８５９?１．１２??ＩｉＡＰ－２?０．９８４９?１．３５??ＨＡＰＴ３?０．９９８３?１．０４??ＨＵＢＣ２９?０．９９９６?０．９７??ＨＲＰＬ１５?０．９９２０?１．０５??ＨＵＢＣ２２?０．９９９０?０．８９??ｌｉｍｅ１９?０．９８４５?０．９４???ＩｉＴＵＢ４?０．９７９０?＼Ａ２２．３．３?１０個(gè)候選內(nèi)參基因的ｑＲＴ－ＰＣＲ及原始ｃｔ值分析??運(yùn)用上述經(jīng)檢測擴(kuò)增效率良好的引物，分別以不同的ｃＤＮＡ稀釋２０倍后模板進(jìn)行ｑＲＴ－ＰＣＲ實(shí)驗(yàn)，采用箱式圖對所得原始ｃｔ值進(jìn)行分析（如圖２－３），果顯示所得原始ｃｔ值質(zhì)量較好。??

??迫條件下的最適內(nèi)參基因。表２－３和圖２－４均為ｇｅＮｏｒｍ軟件分析結(jié)果，該結(jié)果表??明在不同發(fā)育階段和不同組織部位，表達(dá)相對穩(wěn)定的內(nèi)參基因均為／／Ｐ尸２Ｈ??／ＭＣ７７和／／ｅ／Ｆ２
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2838951