轉Haace1基因hpRNA煙草植株的獲得及棉鈴蟲RNAi分析
發(fā)布時間:2020-10-13 02:33
棉鈴蟲(Helicoverpa armigera)是重要的農(nóng)業(yè)害蟲,近年來棉鈴蟲的防治問題引起廣泛的關注。本研究以棉鈴蟲體內(nèi)乙酰膽堿酯酶基因為對象,通過轉基因手段獲得表達Haace1基因的hp RNA植株,以探究其抗蟲價值。另外,構建酵母hp RNA表達載體,與細菌表達系統(tǒng)(L4440/HT115)進行的飼喂dsRNA RNAi實驗進行對比,探究酵母表達系統(tǒng)是否適合用于篩選RNAi靶標基因。具體內(nèi)容如下:1.獲得轉Haace1基因煙草及遺傳分析將植物表達載體p RNAi-GG-ace1f、p RNAi-GG-ace1r轉化到農(nóng)桿菌LBA4404中,隨后農(nóng)桿菌菌液侵染煙草外植體,經(jīng)過植物組織培養(yǎng)技術獲得再生苗,卡那抗性篩選和PCR驗證后,共獲得13株T0代Haace1f轉基因煙草和9株T0代Haace1r轉基因煙草;通過卡那抗性對T1代轉基因煙草進行抗性苗和白化苗的統(tǒng)計,結果顯示:5株T0代Haace1f轉基因煙草中,有4株其后代卡那抗性遵循孟德爾3:1分離比,由此推測其為單拷貝插入,一株分離比為2.08:1,不符合孟德爾基因遺傳規(guī)律;5株Haace1r轉基因煙草,都符合孟德爾3:1的分離比,推測其都為單拷貝插入。2.轉基因煙草抗蟲性分析取新鮮的轉基因煙草葉片喂食棉鈴蟲二齡幼蟲,野生型葉片作對照,每隔一定時間觀察葉片咬噬情況和幼蟲生長狀況,RT-qPCR檢測幼蟲體內(nèi)Haace1基因表達情況。結果表明,Haace1f轉基因煙草和Haace1r轉基因煙草對幼蟲體內(nèi)Haace1基因表達均有抑制效果,并且Haace1r轉基因煙草的抑制效果更顯著。3.酵母和大腸桿菌dsRNA表達載體的Feeding-based RNAi分析酵母hp RNA表達載體的構建是將植物表達載體p RNAi-GG-ace1f質(zhì)粒上的目的片段插入到p YES2質(zhì)粒上,并轉化到酵母INVSc1感受態(tài)中。酵母菌液飼喂棉鈴蟲,與大腸桿菌dsRNA表達載體的干涉效果進行對比,RT-qPCR結果分析,表達dsRNA的酵母菌對目的基因的抑制效果不明顯,低于大腸桿菌的抑制效果。以上研究為以Haace1基因為靶標的植物基因工程和棉鈴蟲防治提供一些參考。
【學位單位】:河北大學
【學位級別】:碩士
【學位年份】:2018
【中圖分類】:S433;Q943.2
【部分圖文】:
第 1 章 文獻綜述第 1 章 文獻綜述1.1 乙酰膽堿酯酶研究進展乙酰膽堿(Acetycholine,ACh)是一種神經(jīng)遞質(zhì),存在于神經(jīng)細胞的小泡中由突觸前膜釋放,與突觸后膜上的受體結合;乙酰膽堿酯酶(AcetylcholinestraAChE)能夠在 ACh 發(fā)揮作用后水解其為膽堿和乙酸,使它喪失對突觸后膜的奮作用[1],膽堿大部分能夠再次進入突觸前膜,重新生成為乙酰膽堿分子。
圖 1.2 RNAi 的三種類型 (Lim,2016)Fig.1.2 Three types of RNAiAi 導入方法 實驗中 dsRNA 進入蟲體內(nèi)主要有三種方法:注射法最早在秀麗隱桿線蟲中使用顯微注射法注射 dsRNA組信息的公布,RNAi 技術運用廣泛,這一技術已經(jīng)運用,但是基因沉默效果參差不齊[43]。基于浸泡法因功能信息,適用于大規(guī)模的基因功能篩選,但 ds對于不易吸收 dsRNA 的昆蟲來說,基因沉默效率極用的范圍是有限的[44-45]。昆蟲中導入 dsRNA 的一種重要方法。1998 年,Tim表達的 dsRNA 對秀麗隱桿線蟲進行基因沉默,此后泛應用。目前主要有三種飼喂方法:第 1 種是直接喂
圖 1.3 實驗設計路線Fig.1.3 Experiment design本研究主要包括下面幾部分:1. 獲得 Haace1 轉基因煙草及遺傳分析:植物表達載體 pRNAi-GG-ace1f、pRNAi-GG-ace1r 轉化到農(nóng)桿菌感受態(tài) LBA4404 中,農(nóng)桿菌菌液侵染無菌的煙草外植體,然后通過植物組織培養(yǎng)得到再生苗,即 T0代轉 Haace1 基因煙草,卡那抗性篩選和 PCR 驗證,并對結果均為陽性的 T0代煙草的種子進行遺傳分析。2.轉基因煙草對棉鈴蟲的基因沉默效果:取新鮮的轉基因煙草葉片喂食棉鈴蟲二齡幼蟲,野生型葉片作對照,每隔一定時間觀察葉片咬噬情況和幼蟲生長狀況,RT-qPCR 檢測幼蟲體內(nèi) Haace1 基因表達情況。3. 酵母和大腸桿菌 dsRNA 表達載體的 Feeding-based RNAi 分析:大腸桿菌dsRNA 表達系統(tǒng)(L4440/HT115)由實驗室提供,酵母 hpRNA 表達載體的構建是通過設計合適的酶切位點,將 pRNAi-GG-ace1f 與 pYES2 質(zhì)粒酶切連接,構成
【參考文獻】
本文編號:2838615
【學位單位】:河北大學
【學位級別】:碩士
【學位年份】:2018
【中圖分類】:S433;Q943.2
【部分圖文】:
第 1 章 文獻綜述第 1 章 文獻綜述1.1 乙酰膽堿酯酶研究進展乙酰膽堿(Acetycholine,ACh)是一種神經(jīng)遞質(zhì),存在于神經(jīng)細胞的小泡中由突觸前膜釋放,與突觸后膜上的受體結合;乙酰膽堿酯酶(AcetylcholinestraAChE)能夠在 ACh 發(fā)揮作用后水解其為膽堿和乙酸,使它喪失對突觸后膜的奮作用[1],膽堿大部分能夠再次進入突觸前膜,重新生成為乙酰膽堿分子。
圖 1.2 RNAi 的三種類型 (Lim,2016)Fig.1.2 Three types of RNAiAi 導入方法 實驗中 dsRNA 進入蟲體內(nèi)主要有三種方法:注射法最早在秀麗隱桿線蟲中使用顯微注射法注射 dsRNA組信息的公布,RNAi 技術運用廣泛,這一技術已經(jīng)運用,但是基因沉默效果參差不齊[43]。基于浸泡法因功能信息,適用于大規(guī)模的基因功能篩選,但 ds對于不易吸收 dsRNA 的昆蟲來說,基因沉默效率極用的范圍是有限的[44-45]。昆蟲中導入 dsRNA 的一種重要方法。1998 年,Tim表達的 dsRNA 對秀麗隱桿線蟲進行基因沉默,此后泛應用。目前主要有三種飼喂方法:第 1 種是直接喂
圖 1.3 實驗設計路線Fig.1.3 Experiment design本研究主要包括下面幾部分:1. 獲得 Haace1 轉基因煙草及遺傳分析:植物表達載體 pRNAi-GG-ace1f、pRNAi-GG-ace1r 轉化到農(nóng)桿菌感受態(tài) LBA4404 中,農(nóng)桿菌菌液侵染無菌的煙草外植體,然后通過植物組織培養(yǎng)得到再生苗,即 T0代轉 Haace1 基因煙草,卡那抗性篩選和 PCR 驗證,并對結果均為陽性的 T0代煙草的種子進行遺傳分析。2.轉基因煙草對棉鈴蟲的基因沉默效果:取新鮮的轉基因煙草葉片喂食棉鈴蟲二齡幼蟲,野生型葉片作對照,每隔一定時間觀察葉片咬噬情況和幼蟲生長狀況,RT-qPCR 檢測幼蟲體內(nèi) Haace1 基因表達情況。3. 酵母和大腸桿菌 dsRNA 表達載體的 Feeding-based RNAi 分析:大腸桿菌dsRNA 表達系統(tǒng)(L4440/HT115)由實驗室提供,酵母 hpRNA 表達載體的構建是通過設計合適的酶切位點,將 pRNAi-GG-ace1f 與 pYES2 質(zhì)粒酶切連接,構成
【參考文獻】
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2 趙丹;趙德剛;李巖;;EuFPS基因表達載體構建及對杜仲遺傳轉化的研究[J];基因組學與應用生物學;2009年01期
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4 姜興印,王開運,儀美芹;棉鈴蟲人工飼料概述[J];昆蟲知識;2000年03期
本文編號:2838615
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