藍(lán)莓(Vaccinium spp.)是一種經(jīng)濟(jì)價值較高的越橘類漿果,其果實鮮食甘甜、營養(yǎng)豐富,尤其是果實中富含的花青苷對人體健康有諸多益處。因此挖掘藍(lán)莓果實發(fā)育調(diào)控因子并利用分子遺傳手段針對性的進(jìn)行品種改良或培育藍(lán)莓新品種不僅具有重要的經(jīng)濟(jì)意義,而且在人類健康方面具有重要的社會意義。miRNA是一類長度為18-24nt的內(nèi)源非編碼RNA,是調(diào)控基因表達(dá)的重要作用因子,在果實發(fā)育和成熟過程中扮演重要角色。然而目前關(guān)于藍(lán)莓miRNA方面的研究還少有報道。本研究利用小RNA測序和降解組測序技術(shù)對藍(lán)莓果實發(fā)育的兩個關(guān)鍵時期(白熟期和藍(lán)熟期)的miRNA及其靶標(biāo)進(jìn)行鑒定,并構(gòu)建了miRNA介導(dǎo)藍(lán)莓果實發(fā)育的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。進(jìn)一步利用藍(lán)莓轉(zhuǎn)化體系成功的將藍(lán)莓VcMIR156基因轉(zhuǎn)入到藍(lán)莓中,為深入研究該MIR基因的功能奠定了基礎(chǔ)。具體研究結(jié)果如下:1.構(gòu)建了藍(lán)莓果實白熟期和成熟期sRNA測序文庫和降解組測序文庫,在sRNA測序文庫中鑒定了100個miRNA。其中包括來自28個miRNA家族的84個已知miRNA和16個新的miRNA。我們挑選從測序結(jié)果中挑選16個miRNA用stem-loop qPCR方法進(jìn)行驗證,stem-loop qPCR結(jié)果與sRNA測序結(jié)果基因表達(dá)趨勢基本一致;降解組測序共鑒定了41個已知miRNA和7個新miRNA的178個靶標(biāo)。用RLM-RACE對藍(lán)莓miR160的兩個靶標(biāo)進(jìn)行檢測,從而驗證了降解組測序的準(zhǔn)確性。2.為了探究藍(lán)莓中已知miRNA的保守性,我們從NCBI下載葡萄成熟miRNA和pre-miRNA的序列并與藍(lán)莓sRNA測序得到的數(shù)據(jù)一起構(gòu)建了進(jìn)化樹,結(jié)果表明藍(lán)莓中的miRNA與葡萄中的miRNA親緣關(guān)系較近,藍(lán)莓已知miRNA的保守性很高。3.為了探究藍(lán)莓miRNA在藍(lán)莓果實發(fā)育中的作用,對測到的100個miRNA根據(jù)其表達(dá)量進(jìn)行聚類分析,發(fā)現(xiàn)藍(lán)熟期與白熟期相比,共68個miRNA上調(diào)表達(dá),推測這些miRNA可能在藍(lán)莓果實的發(fā)育和成熟過程中發(fā)揮作用。4.利用stem-loop qPCR和qRT-PCR方法分析了6個miRNA和其靶基因在藍(lán)莓果實發(fā)育的不同時期的表達(dá)模式,結(jié)果顯示這6個mi RNA和它們的靶基因表達(dá)模式呈負(fù)相關(guān),表明這6個miRNA通過負(fù)向調(diào)控它們的靶標(biāo),實現(xiàn)對藍(lán)莓果實的發(fā)育和成熟的調(diào)控作用。5.GO分析發(fā)現(xiàn)miRNA的靶基因參與了生物學(xué)進(jìn)程(biologic process)、細(xì)胞組分(cellular component和分子功能(molecular function)等過程。6.成功將VcMIR156通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法在藍(lán)莓中進(jìn)行過量表達(dá),PCR結(jié)果證明VcMIR156已經(jīng)被成功轉(zhuǎn)到藍(lán)莓基因組中。qRT-PCR結(jié)果表明與野生型藍(lán)莓相比,轉(zhuǎn)基因藍(lán)莓中藍(lán)莓pre-miR156的表達(dá)量明顯升高,而VcMIR156的6個靶基因在轉(zhuǎn)基因藍(lán)莓中表達(dá)量顯著降低,由此證明我們轉(zhuǎn)入的基因可以正常表達(dá),并行使功能。這些研究結(jié)果不僅為全面理解藍(lán)莓果實成熟調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供新思路,而且為藍(lán)莓miRNAs的功能研究奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S663.9
【部分圖文】：

iRNA起源于基因間隔區(qū)的非編碼區(qū)域，在級轉(zhuǎn)錄本（pri-miRNA），pri-miRNA 具結(jié)構(gòu)[8,9]。之后 pri-miRNA 經(jīng) DCL1 酶（NASTIC LEAVES1），C2H2 鋅脂蛋白BC 協(xié)同作用下形成具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的 pre-A極不穩(wěn)定，進(jìn)一步被DCL1和HYL1切。隨后，在 miRNA 甲基轉(zhuǎn)移酶 HEN1（最后一個核苷酸發(fā)生甲基化以提高其穩(wěn)定A*復(fù)合體依賴 HASTY 轉(zhuǎn)運體從細(xì)胞核NA：miRNA*復(fù)合體中 miRNA 鏈選擇性，形成 miR-RISC 復(fù)合體，并進(jìn)行靶基NA*鏈隨后被降解[12]。

苷生物合成途徑大體相同，但中間產(chǎn)物和反應(yīng)底物存在飛燕草素，而在牽�；ㄖ胁荒苄纬商祗每爻煞忠泊嬖诓町�，這些都是由于基因選擇性表達(dá)苷的前體都是丙二酰-COA。植物體內(nèi)花青苷生物段：首先苯丙氨酸在苯丙氨酸裂解酶（PAL）的酸羥化酶（CH4）作用下合成 4-香豆酰 COA，隨后合成酶的催化下合成查爾酮，經(jīng)黃烷酮-3-羥化酶，此過程在花青苷和成過程中起到關(guān)鍵作用[23]。（DFR）將二羥黃酮醇還原為無色飛燕草素，無無色原花青苷素；之后原花青苷素在花青苷糖基轉(zhuǎn)基化，甲基化，羥基化修飾等，此過程在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)移酶（GST）協(xié)同作用下將花青苷轉(zhuǎn)運到液泡。

圖 2.1 不同長度的 miRNA 在兩個文庫中的 reads 數(shù)Fig.2.1 Reads numbers of miRNAs in different lengths in two libraries為了進(jìn)一步發(fā)掘藍(lán)莓 miRNA 的功能，我們也構(gòu)建了藍(lán)莓果實白熟期和成熟期降解組文庫，最終在這兩個文庫中依此測得10686450和13702581個raw reads。大約4.49M和4.96M條序列可以匹配到藍(lán)莓參考序列中（藍(lán)莓轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和EST是數(shù)據(jù)庫），其中超過 55%測得的序列可以匹配到藍(lán)莓 cDNA 數(shù)據(jù)庫（表 2.6）。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前7條

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本文編號：2830185