研究背景和目的:隨著人們生活水平的提高以及飲食結(jié)構(gòu)的改變,肥胖(Obesity)人群也在持續(xù)的增長,肥胖對人體心血管系統(tǒng)產(chǎn)生很多不利影響,諸如增加心臟組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)等。有文獻報道,敲除CD38基因能夠有效抑制高脂飲食喂養(yǎng)誘導(dǎo)的肥胖發(fā)生;我們實驗室的前期研究也發(fā)現(xiàn),敲除CD38基因可以通過激活Sirt1/FOXOs介導(dǎo)的抗氧化應(yīng)激通路保護心臟的缺血再灌注損傷。然而,CD38基因在脂質(zhì)超載導(dǎo)致的心臟組織損傷過程中的作用及其機制尚不清楚。因此,本課題的研究旨在探索CD38基因敲除對高脂飲食喂養(yǎng)誘導(dǎo)心臟組織損傷的保護作用及其機制,以期為脂超載造成的心臟損傷的預(yù)防和治療提供新的重要靶點和實驗依據(jù)。實驗方法:1.高脂飲食誘導(dǎo)心臟脂質(zhì)超載模型的制備及其分析:將8-10周齡的C57BL/6背景小鼠隨機分成兩組:(1)Wild Type小鼠組;(2)CD38~(-/-)小鼠組,每組小鼠數(shù)量為5-6只,然后兩組同時進行高脂飲食(HFD)喂養(yǎng)12周,最后取小鼠心臟進行代謝組學分析,分析敲除CD38基因?qū)χ|(zhì)超載誘導(dǎo)心臟損傷的影響。2.心肌細胞脂質(zhì)累積模型的制備及其分析:正常和CD38 Knockdown的H9C2心肌細胞在0.5 mM油酸(OA)刺激24 h后,用油紅染色檢測細胞內(nèi)脂質(zhì)累積情況、甘油三酯試劑盒檢測細胞內(nèi)TG含量、CCK8檢測細胞活力、試劑盒檢測LDH和SOD酶活性、細胞內(nèi)ROS含量檢測等確定干擾CD38基因?qū)π募〖毎挠绊憽?.機制分析:根據(jù)小鼠心臟組織的代謝組學結(jié)果,Western Blot檢測與脂質(zhì)合成有關(guān)基因FASN的表達;Western Blot和Q-PCR檢測心肌細胞Sirt3及其靶蛋白FOXO3蛋白和mRMA表達水平;Western Blot和Q-PCR檢測與氧化應(yīng)激及凋亡有關(guān)基因的表達,明確CD38基因敲除保護脂質(zhì)過載誘導(dǎo)心臟損傷的分子機制。實驗結(jié)果:1.CD38缺失明顯改變高脂誘導(dǎo)的心肌細胞代謝產(chǎn)物:經(jīng)心肌細胞代謝主成分及聚類分析發(fā)現(xiàn),高脂飲食(HFD)喂養(yǎng)WT小鼠和CD38~(-/-)小鼠心臟中的化合物具有顯著差異,檢測的271種代謝物中有87種存在顯著性差異,其中60種化合物在CD38~(-/-)小鼠心臟中含量明顯升高,27種代謝物明顯降低。2.HFD喂養(yǎng)CD38~(-/-)小鼠心臟組織內(nèi)NAD~+、NAD~+的前體化合物NMN、煙酰胺、ADPR的含量都明顯高于WT對照小鼠,還原型GSH的含量增加,氧化型GSSG含量降低,其GSH/GSSG比值升高。3.油酸(OA)刺激后,相比于對照組,CD38基因敲減的心肌細胞活力明顯增加,SOD的酶活性明顯升高,LDH活性和ROS的含量顯著降低。4.HFD喂養(yǎng)CD38~(-/-)小鼠,其心臟內(nèi)的長鏈脂肪酸和多不飽和脂肪酸的含量都明顯低于WT組。而且在OA處理后,CD38基因敲減的心肌細胞內(nèi)脂質(zhì)累積及細胞內(nèi)TG含量都明顯低于對照組,FASN的表達也明顯降低。5.OA刺激后,心肌細胞內(nèi)總蛋白乙�；斤@著上調(diào)。但與對照組相比,CD38敲減組的總蛋白乙�；斤@著下降,而且Sirt3、SOD2和FOXO3a的蛋白質(zhì)水平和mRNA水平都明顯高于對照組。6.加或不加OA處理,CD38敲減的心肌細胞內(nèi)NOX2、NOX4和Bax基因的表達都明顯低于對照組,Bcl2基因的表達明顯增加,Bcl2/Bax比值則顯著增加。結(jié)論:1、CD38基因敲除降低心臟脂質(zhì)超載誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷及細胞凋亡。2、CD38基因敲除在體內(nèi)外均可降低心肌細胞脂質(zhì)合成。3、CD38基因敲除對脂質(zhì)超載所致心肌氧化應(yīng)激損傷的作用機制可能與其激活心肌細胞Sirt3/FOXO3a信號通路有關(guān)。
【學位單位】：南昌大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R589.2
【部分圖文】：

在高脂飲食喂養(yǎng)下敲除CD38基因?qū)π呐Kstearoylsphingomyesarcosine(N-4.00GroupWTCD38

圖 2 在高脂飲食喂養(yǎng)下敲除 CD38 基因?qū)π呐K組織 NAD+代謝的影響。（A）HFD 的 WT和 CD38 基因敲除小鼠心臟內(nèi) NAD+及其前體化合物 NMN 的相對含量；（B）HFD 的 WT和 CD38 基因敲除小鼠心臟與 CD38 相關(guān)的代謝物 nicotinamide 和 ADPR 的相對含量；（C）HFD 的 WT 和 CD38 基因敲除小鼠心臟內(nèi) GSH 和 GSSG 的含量；（D）HFD 的 WT 和 CD38基因敲除小鼠心臟 GSH/GSSG 的比值。P*＜0.05，P**＜0.01，P***＜0.001，n=5。

圖 3 干擾 H9C2 心肌細胞的 CD38 基因能夠保護 OA 誘導(dǎo)的細胞凋亡和氧化應(yīng)激損傷。（A）Q-PCR 檢測干擾 CD38 基因的 H9C2 穩(wěn)定細胞系 CD38 的 mRNA 水平；（B）WB 檢測干擾CD38 基因的 H9C2 穩(wěn)定細胞系 CD38 的蛋白質(zhì)水平；（C）正常的和 CD38 干擾的 H9C2細胞用 OA 分別處理 6h（左）和 12h（右）后用 CCK8 檢測的細胞增殖情況；（D）正常的和 CD38 干擾的 H9C2 細胞用 0.5mM 的 OA 處理 24 小時后培養(yǎng)液內(nèi)的 LDH 酶活性（490nm,OD 值）；（E）正常的和 CD38 干擾的 H9C2 細胞用 0.5mM 的 OA 處理 24 小時后培養(yǎng)液內(nèi)的 SOD 酶活性（450nm,OD 值）；（F）利用流式細胞儀檢測不同細胞組 ROS產(chǎn)生的熒光強度。 P*<0.05，P**<0.01，P***<0.001，n ≥3 。確定了 H9C2 細胞的 CD38 干擾效率后，我們用 0.5 mM 濃度的 OA 分別處理細胞 6 小時和 12 小時，利用 CCK-8 檢測細胞活力。正如圖 3.C 所示，與對照組相比，轉(zhuǎn)染了 CD38 SiRNA 的 H9C2 穩(wěn)定細胞系在 OA 分別處理 6 小時和 12小時后的細胞活力都是明顯增加的，這些結(jié)果證明干擾 CD38 基因可以有效的抵抗 OA 刺激導(dǎo)致的細胞毒性。實驗結(jié)果還顯示，OA 處理可以明顯的增加細胞乳酸脫氫酶（LDH）的活性，而與對照組相比，干擾 CD38 基因則顯著降低 LDH的活性（圖 3. D）。另外，我們的實驗數(shù)據(jù)還顯示，與對照組相比，干擾 CD38

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本文編號：2830013