九孔鮑(Haliotis diversicolor supertexta)是中國南方沿海具有較高經(jīng)濟價值的海水養(yǎng)殖貝類,20世紀90年代中后期以來,開始爆發(fā)疾病導致九孔鮑大規(guī)模死亡,給九孔鮑產(chǎn)業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失,限制了我國九孔鮑產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。種質(zhì)退化是九孔鮑病害爆發(fā)和死亡的主要原因,通過遺傳改良選育出抗性強,培育出生長快的品種是解決九孔鮑病害爆發(fā)和死亡的主要途徑。在分子水平研究生長相關(guān)基因的分子調(diào)控機制并篩選與生長性狀相關(guān)的分子標記,有助于培育出抗性強、生長快的九孔鮑品種。轉(zhuǎn)化生長因子超家族(transforming growth factor type beta,TGF-β)是一組具有結(jié)構(gòu)相關(guān)性的多功能分泌型細胞因子,參與細胞增殖、分化和生長等多種生物學過程。肌肉生長抑制素(MSTN)是轉(zhuǎn)化生長因子β超家族(TGF-β)中參與動物肌肉生長的重要調(diào)控因子,是經(jīng)濟動物遺傳改良的重要候選基因;骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)是轉(zhuǎn)化生長因子超家族(TGF-β)中最大的分泌型信號傳導分子,在動物的骨骼發(fā)育及器官形成中具有重要作用,BMP-2基因是BMP家族的重要成員,在信號傳遞、貝殼形成過程中具有重要作用。為探究MSTN、BMP-2基因在九孔鮑中的功能,克隆九孔鮑MSTN、BMP-2基因cDNA全長,利用生物信息學分析了基因序列和氨基酸特征,并運用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)檢了MSTN、BMP-2基因在各組織和發(fā)育時期的表達水平。為探究九孔鮑MSTN、BMP-2基因的多態(tài)性及生長相關(guān)性,采用PCR產(chǎn)物直接測序的方法對九孔鮑MSTN、BMP-2基因進行SNP篩選,并通過基因多態(tài)性與九孔鮑體質(zhì)量、殼長、殼寬進行關(guān)聯(lián)分析,運用qRT-PCR技術(shù)檢測了MSTN基因不同基因型九孔鮑的表達水平。為九孔鮑生長相關(guān)分子機制的研究、生長標記的開發(fā)和標記輔助選擇育種提供參考。主要研究結(jié)果如下:1、九孔鮑MSTN基因cDNA克隆及表達采用cDNA末端快速擴增(RACE)技術(shù)從九孔鮑右側(cè)殼肌中獲得了MSTN基因cDNA全長3755 bp,其中5′非編碼區(qū)(5′UTR)324 bp,3′非編碼區(qū)(3′UTR)1985 bp,開放閱讀框(ORF)1446 bp,編碼481個氨基酸,分子質(zhì)量為54.96 ku,理論等電點pI:9.41;具有N端信號肽(1-17aa)、TGF-β前肽區(qū)域(157-367aa)和成熟肽區(qū)域(379-481aa),以及蛋白酶水解位點RRPR(364-368 aa)和C末端生物活性區(qū)9個保守的半胱氨酸殘基,符合TGF-β超家族蛋白典型結(jié)構(gòu)特征,且預測到2個新的蛋白酶水解位點RQRR(120-124 aa)、RYRR(235-239 aa)。系統(tǒng)進化樹結(jié)果顯示九孔鮑MSTN基因和紅鮑MSTN基因聚為一支。qRT-PCR結(jié)果表明,九孔鮑MSTN基因在檢測的6個組織均表達且在足、右側(cè)殼肌、外套膜中高表達,在鰓、性腺、肝臟中低表達;在檢測的7個發(fā)育時期均表達且在受精卵、原腸胚、稚鮑時期高表達,在卵、4細胞、8細胞時期、幼鮑時期表達量較低。研究表明MSTN基因可能在九孔鮑肌肉生長中具有重要作用。2、九孔鮑BMP-2基因cDNA克隆及表達采用cDNA末端快速擴增(RACE)技術(shù)從九孔鮑外套膜中獲得了BMP-2基因cDNA全長2572 bp,其中5′非編碼區(qū)(5′UTR)123 bp,3′非編碼區(qū)(3′UTR)1150 bp,開放閱讀框(ORF)為1299 bp,編碼432個氨基酸,其分子質(zhì)量為48.59 ku,理論等電點(pI)為9.84;具有N端信號肽(1-39 aa)、TGF-β前肽區(qū)域(63-294 aa)和TGF-β成熟肽區(qū)域(331-432 aa),以及蛋白酶水解位點RLRR(272-275 aa)和7個保守的半胱氨酸殘基,符合TGF-β超家族蛋白典型結(jié)構(gòu)特征。系統(tǒng)進化樹結(jié)果顯示九孔鮑BMP-2基因和耳鮑聚為一支。qRT-PCR結(jié)果表明,BMP-2基因在九孔鮑的6個組織中均有表達,在足、右側(cè)殼肌、外套膜及肝臟中顯著高表達;在檢測的7個發(fā)育時期均表達,其中在受精卵、4細胞、8細胞、原腸胚、稚鮑時期表達量顯著高于卵、幼鮑時期。研究表明BMP-2基因可能在九孔鮑貝殼形成中具有重要作用。3、九孔鮑MSTN基因多態(tài)性及與生長性狀關(guān)聯(lián)分析實驗采用PCR產(chǎn)物直接測序的方法在九孔鮑MSTN基因中,共篩選出了9個SNP位點,5′非編碼區(qū)(5′UTR)1個SNP位點為g252GA;開放閱讀框(ORF)4個SNP位點為g414AC、g558CA、g909CT和g960AT;3′非編碼區(qū)(3′UTR)4個SNP位點為g2148GA、g2164AG、g2420CG和g2520CG,9個SNP位點均檢測到3種基因型。其中開放閱讀框中的4個SNP位點突變均不改變所編碼的氨基酸,為同義突變,九孔鮑MSTN基因9個SNP位點的期望雜合度(He)和觀測雜合度(Ho)分別在0.2155-0.4778和0.2195-0.4471間,多態(tài)信息含量(PIC)的范圍為0.1913-0.3621,除g2164AG為低度多態(tài)性外,其余均為中度多態(tài)性。哈迪-溫伯格平衡(HWE)檢驗結(jié)果表明,除g2420CG位點外,其余8個SNP位點均符合哈迪-溫伯格平衡。SNP位點與生長性狀關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示九孔鮑MSTN基因編碼區(qū)SNP位點g909CT發(fā)生C/T同義突變,與九孔鮑體質(zhì)量、殼長、殼寬顯著相關(guān),TT基因型九孔鮑的體質(zhì)量顯著高于CC基因型和TC基因型的個體,TT基因型的殼長、殼寬顯著高于CC基因型(P0.05)。qRT-PCR檢測結(jié)果表明,在九孔鮑MSTN基因SNP位點g909CT 3種基因型中,TC和CC基因型的基因表達量顯著高于TT基因型(P(27)0.05)。研究結(jié)果表明MSTN基因SNP位點可作為九孔鮑標記輔助選擇育種重要候選標記。4、九孔鮑BMP-2基因多態(tài)性及與生長相關(guān)性分析實驗采用PCR產(chǎn)物直接測序的方法在九孔鮑BMP-2基因中共篩選出了4個SNP位點,開放閱讀框2個SNP位點為g1176GA、g1275CT;3′非編碼區(qū)2個SNP位點為g1436GT、g1506GT,4個SNP位點的期望雜合度(He)和觀測雜合度(Ho)分別在0.1287-0.3895和0.1713-0.4762間,多態(tài)信息含量(PIC)的范圍為0.1560-0.3615。研究結(jié)果表明九孔鮑實驗的群體為中度遺傳多樣性,在九孔鮑BMP-2基因篩選到4個SNP位點,為九孔鮑標記輔助選擇育種提供參考資料。
【學位單位】：廣東海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：S917.4
【部分圖文】：

182.2.2 MSTN 基因同源性及系統(tǒng)進化分析運用 NCBI 在線 Blastx 比對，結(jié)果表明：九孔鮑 MSTN 氨基酸序列與紅鮑(Haliotisrufescens)相似性最高，為 76%，與其他物種相似性較低�；� NJ 法構(gòu)建 MSTN 氨基酸序列系統(tǒng)進化樹，結(jié)果顯示：所有魚類和無脊椎動物先聚類隨后聚在一起形成一簇，哺乳動物單獨聚類為一簇。在無脊椎動物中，九孔鮑、紅鮑、蝦夷扇貝；凡納濱對蝦 (Litopenaeus vannamei)、墨吉明對蝦(Fenneropenaeusmerguiensis)；瘤背石磺(Onchidium struma)、縊蟶(Sinonovacula constricta)、合浦珠母貝 (Pinctada martens)、紫扇貝(Argopecten purpuratus)；各聚為一支(圖 2-3)。圖 2-2b 九孔鮑 MSTN 基因預測二級結(jié)構(gòu)(A）、三級結(jié)構(gòu)(B)和結(jié)構(gòu)域(C)Fig .2-2b The prediction of MSTN secondary structure(A) and tertiary structure(B) and structuraldomain(C) H. diversicolor supertexta

28圖 3-2 BMP-2 氨基酸序列比對蛋白酶水解位點(RXXR），單下劃線標注 TGF-β 前肽區(qū)域，雙下劃線標注成熟區(qū)域ultiple sequences alignment of BMP-2 amino acid squences from differentspeciescessing site(RXXR）are show in the boxed，the predicted TGF-β prepetide domain and TGF-βomain are show in single underline and double underline respectively

3.2.3 BMP-2 基因表達分析通過熒光定量 PCR 分析 HS-BMP-2 基因在各組織和顯示：BMP-2 基因在九孔鮑 6 個組織中均有表達，在足中高表達，在性腺、鰓中低表達(P<0.05) (圖 3-5a)；在檢BMP-2 基因在九孔鮑受精卵時期表達量最高，其次是受胚、稚鮑時期，在卵、幼鮑時期表達量最低(P<0.05) (圖圖 3-4 基于 NJ 法構(gòu)建 BMP-2 氨基酸序列系Fig.3-4 Phylogenetic tree of BMP-2 was constructed usingmethod50100bbbb量expressionn

【參考文獻】

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本文編號：2829541