紅松(Pinus koraiensis Sieb.et Zucc.)主要生長(zhǎng)分布于中國(guó)東北東部山區(qū),具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值及生態(tài)價(jià)值。肉桂醇脫氫酶(Cinnamoylalcohol dehydrogenase CAD)催化木質(zhì)素還原反應(yīng)中的第二步反應(yīng),即將三種肉桂醛:咖啡醛,松柏醛,5-羥基松柏醛還原為三種肉桂醇:咖啡醇,松柏醇,5-羥基松柏醇。內(nèi)根-貝殼杉烯合成酶(ent-Kaurene synthase KS)在赤霉素合成途徑中催化柯巴焦磷酸鹽(CPP)合成內(nèi)根-貝殼杉烯,是赤霉素合成途徑中前期的關(guān)鍵步驟。GA20氧化酶(GA 20-oxidase GA20)在與GA3氧化酶,GA2氧化酶等協(xié)同作用下,將GA12-醛轉(zhuǎn)化為各種具有生物活性的GA。幾丁質(zhì)酶(Chitinase Chi)在植物中主要作為抵御蟲病害,抗低溫的抗逆性蛋白發(fā)揮作用。通過對(duì)紅松以上幾種酶的研究,可為紅松種子,木材的產(chǎn)量,產(chǎn)率與紅松植株抗病害方面做出貢獻(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)利用同源序列克隆法從紅松中克隆得到了紅松CAD,KS,GA20,Chi基因,并將以上四基因分別與表達(dá)載體連接后在大腸桿菌BL21細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。為提高紅松木材,種子產(chǎn)量,提高抗病性研究打下了基礎(chǔ),研究結(jié)果如下:1,對(duì)紅松CAD基因進(jìn)行了克隆測(cè)序,結(jié)果表明:紅松CAD基因全長(zhǎng)為1074bp,所編碼蛋白質(zhì)包含357個(gè)氨基酸,分子量為38.9kd,分子式為C_(1714)H_(2741)N_(455)O_(517)S_(29,)等電點(diǎn)為5.80。與其他物種CAD基因進(jìn)行多序列對(duì)比結(jié)果表明,紅松CAD基因序列與火炬松,挪威云杉等具有較高一致性,其親緣關(guān)系較近。構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果表明,與紅松CAD基因親緣關(guān)系最近的是輻射松和火炬松。將紅松CAD基因序列上傳至Genbank,登錄號(hào)為MG764438。將紅松CAD基因在大腸桿菌BL21細(xì)胞中表達(dá),SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)入紅松CAD基因表達(dá)載體的工程菌表達(dá)了長(zhǎng)度約為39kd的蛋白,與理論預(yù)期相符。2,對(duì)紅松GA20基因進(jìn)行了克隆測(cè)序,結(jié)果表明:紅松GA20基因全長(zhǎng)為1116bp,所編碼蛋白質(zhì)包含371個(gè)氨基酸,分子量為42.03kd,分子式為C_(1893)H_(2911)N_(511)O_(543)S_(16),等電點(diǎn)為6.89。與其他物種GA20基因進(jìn)行多序列對(duì)比結(jié)果表明,紅松GA20基因序列與油松,白云杉等具有較高一致性,其親緣關(guān)系較近。構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果表明,與紅松GA20基因親緣關(guān)系最近的是油松和赤松。將紅松GA20基因序列上傳至Genbank,登錄號(hào)為MG764439。將紅松GA20基因在大腸桿菌BL21細(xì)胞中表達(dá),SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)入紅松GA20基因表達(dá)載體的工程菌表達(dá)了長(zhǎng)度約為42kd的蛋白,與理論預(yù)期相符。3,對(duì)紅松KS基因進(jìn)行了克隆測(cè)序,結(jié)果表明:紅松KS基因全長(zhǎng)為2283bp,所編碼的蛋白質(zhì)包含760個(gè)氨基酸,分子量為85.96kd,分子式為C_(3815)H_(6006)N_(1050)O_(1131)S_(40),等電點(diǎn)為6.10。與其他物種KS基因進(jìn)行多序列對(duì)比結(jié)果表明,紅松KS基因序列與白云杉具有較高一致性,其親緣關(guān)系較近。構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果表明,與紅松KS基因親緣關(guān)系最近的是輻射松和白云杉。將紅松KS基因序列上傳至Genbank,登錄號(hào)為MG764440。將紅松KS基因在大腸桿菌BL21細(xì)胞中表達(dá),SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)入紅松KS基因表達(dá)載體的工程菌表達(dá)了長(zhǎng)度約為86kd的蛋白,與理論預(yù)期相符。4,對(duì)紅松Chi基因進(jìn)行了克隆測(cè)序,結(jié)果表明:紅松Chi基因全長(zhǎng)為831bp,所編碼的蛋白質(zhì)包含276個(gè)氨基酸,分子量為28.27kd,分子式為C_(1220)H_(1874)N_(340)O_(393)S_(21),等電點(diǎn)為8.64。與其他物種Chi基因進(jìn)行多序列對(duì)比結(jié)果表明,紅松Chi基因序列與白云杉,挪威云杉等具有較高一致性,其親緣關(guān)系較近。構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果表明,與紅松Chi基因親緣關(guān)系最近的是挪威云杉,北美云杉。將紅松Chi基因序列上傳至Genbank,登錄號(hào)為MG764441。將紅松Chi基因在大腸桿菌BL21細(xì)胞中表達(dá),SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)入紅松Chi基因表達(dá)載體的工程菌表達(dá)了長(zhǎng)度約為28kd的蛋白,與理論預(yù)期相符。
【學(xué)位單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S791.247;Q943.2
【部分圖文】：

圖 1.1 木質(zhì)素構(gòu)成基質(zhì)的三種苯丙烷衍生物結(jié)構(gòu)素合成途徑主要由三個(gè)過程：1，莽草酸途徑；2，類苯丙酸途徑。第一步莽草酸途徑是植物進(jìn)行光合作用合成葡萄糖，并將葡萄糖

圖 1.2 木質(zhì)素合成途徑肉桂醇脫氫酶（CAD）是木質(zhì)素合成途徑中特異途徑的關(guān)鍵酶之一，催化香豆醛，芥子醛，松柏醛等肉桂醛合成相應(yīng)的肉桂醇作為木質(zhì)素單體的前體。目前

圖 1.3 赤霉素主要生物合成途徑目前赤霉素對(duì)紅松球花分化，結(jié)實(shí)時(shí)間等方面的影響已經(jīng)得到證實(shí)[33]。孫文對(duì)隨機(jī)分組紅松用不同濃度的赤霉素 GA3+GA4/7 誘導(dǎo)紅松球花分化，結(jié)果表

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