柑橘是我國栽培面積最大的果樹,其果實(shí)品質(zhì)深受柑橘病害的影響,為減少化學(xué)藥劑的使用,培育柑橘的抗病品種成為了柑橘病蟲害防治的最有效最直接的選擇。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展,基因育種越來越受到人們的重視,對于柑橘抗病基因的研究也愈發(fā)深入。柑橘真菌性病害如柑橘褐斑病、炭疽病等對樹體、果實(shí)都有巨大的影響,對我國柑橘產(chǎn)業(yè)造成了嚴(yán)重影響。Mlo基因是一類新發(fā)現(xiàn)的植物抗病基因家族,不同于傳統(tǒng)抗病基因R基因的“基因?qū)颉蹦Ｊ?其隱性等位基因mlo基因在許多植物如大麥、擬南芥、葡萄、番茄等中均表現(xiàn)出對真菌性病害白粉病的非專化廣譜性抗性,在植物的抗病育種上Mlo基因表現(xiàn)出巨大的潛力,有很高的研究價值。但在柑橘中尚未有Mlo基因的相關(guān)研究報(bào)道,因此本試驗(yàn)對柑橘的Mlo基因家族成員進(jìn)行了相關(guān)研究,主要研究結(jié)果如下:1、通過對從數(shù)據(jù)庫獲得的柑橘基因序列進(jìn)行比對和保守結(jié)構(gòu)域分析獲得了15個具有Mlo基因家族保守結(jié)構(gòu)域的柑橘(克里曼丁,Citrus clementina)CiMlo基因家族成員。對這15個CiMlo基因家族成員的蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì)、跨膜結(jié)構(gòu)域、保守結(jié)構(gòu)域、信號肽和亞細(xì)胞定位進(jìn)行了預(yù)測。發(fā)現(xiàn)這15個CiMLO蛋白均為弱堿性蛋白;其中9個CiMLO蛋白為疏水性的穩(wěn)定蛋白;具有6-8個跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域;僅CiMlo242和CiMlo446兩個蛋白預(yù)測有信號肽,其余13個CiMLO蛋白預(yù)測沒有信號肽;亞細(xì)胞定位預(yù)測顯示15個CiMLO蛋白均定位在細(xì)胞膜上。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示進(jìn)化樹分為7個分支,柑橘的15個CiMlo基因分散在7個分支中,其中包括CiMlo092和CiMlo281在內(nèi)的8個基因與已報(bào)道的其它植物中與白粉病互作相關(guān)的基因處于相同分支。從二倍體克里曼丁的葉片中克隆得到了CiMlo092和CiMlo281兩個基因的完整CDS序列,經(jīng)比對發(fā)現(xiàn)其序列具有完整的開放閱讀框,與數(shù)據(jù)庫中Ciclev10028092、Ciclev10031281兩個基因的CDS序列完全一致。2、利用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)對CiMlo092和CiMlo281基因在褐斑病感病品種LW10、金秋砂糖橘、紅桔、抗病品種LW40、大雅、無核沃柑和炭疽病感病品種LW24、抗病品種LW12的葉片中的表達(dá)進(jìn)行了分析。發(fā)現(xiàn)CiMlo092基因在褐斑病菌誘導(dǎo)后表達(dá)量有明顯提高,且在感病品種中響應(yīng)比抗病品種更快,CiMlo281基因表達(dá)量也有顯著上升,但在各個品種中變化規(guī)律不明顯。在炭疽病菌誘導(dǎo)后,在抗病和感病品種中兩個基因表達(dá)量明顯下調(diào),僅在第7天略微有所上調(diào),隨后又降低。3、構(gòu)建了CiMlo092和CiMlo281兩個基因的超量表達(dá)載體和干擾載體,并通過基因克隆重組技術(shù),驗(yàn)證獲得了超量表達(dá)重組質(zhì)粒CiMlo092-D17、CiMlo281-D17,和干擾載體重組質(zhì)粒pGBI-CiMlo092、pGBI-CiMlo281。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化和植物組織培養(yǎng)獲得了柑橘再生芽和煙草再生幼苗,為后續(xù)抗病性評價提供材料。將CiMlo092和CiMlo281兩個基因的超量表達(dá)載體轉(zhuǎn)入煙草葉片中對兩個基因進(jìn)行亞細(xì)胞定位,結(jié)果顯示該兩個基因均定為在細(xì)胞膜上。
【學(xué)位單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S666
【部分圖文】：

2003）誘發(fā)更強(qiáng)大的防御反應(yīng)以抵御病原菌的入侵如圖1-1。R 基因介導(dǎo)的寄主性抗性一般在感病物種的抗病基因型個體中表達(dá)，寄主性抗性通常具有病原特異性，即寄主性抗性僅限于對特定的病原菌而且通常是該病原菌特定的基因型具有抵抗作用（Hammond-Kosack K E，1997）。圖 1-1 植物與病原菌的互作以及抗病性的發(fā)展（MayankAnand Gururani，2012）Fig.1-1 The interaction between plants and pathogens and the development of disease resistance1.1.2. 植物防衛(wèi)反應(yīng)植物受外界病原入侵時在抗病機(jī)制的調(diào)控下會發(fā)生一系列的防衛(wèi)反應(yīng)，其防衛(wèi)反應(yīng)主要包括兩種措施。第一是細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的增強(qiáng)，植物在受到病原體侵染和受到損傷時，將調(diào)控增加木質(zhì)素的合成量以提高細(xì)胞壁的厚度；甘氨酸蛋白和強(qiáng)脯氨酸糖蛋白這兩類細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)蛋白也將增加合成量以鞏固細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)；同時過氧化物酶催化苯基類丙烷醇經(jīng)過脫氫聚合等一系列反應(yīng)最終生成木質(zhì)素，該木質(zhì)素可抵抗微生物的降解并催化細(xì)胞壁蛋白與多糖分子之間的交聯(lián)。第二是誘導(dǎo)

構(gòu)域以及 C 端的一個胞內(nèi)絲-蘇氨酸蛋白激酶結(jié)構(gòu)域（SongWY，1995），如水的抗白葉枯病基因 Xa21。第五類 R 基因 TrD-CC，這類蛋白質(zhì)由跨膜結(jié)構(gòu)域 T和卷曲螺旋結(jié)構(gòu)構(gòu)成，以擬南芥抗白粉病基因 RPW8 為代表（Wang W，2009第六類 R 基因 LRR-TrD-PEST-ECS，這類以番茄的 VE1、VE2 基因?yàn)榇淼牡百|(zhì)中包括推測存在的胞外 LRRs 結(jié)構(gòu)，和一個與蛋白質(zhì)降解有關(guān)的 PEST （PGlu-Ser-Thr）模塊以及一個介導(dǎo)受體進(jìn)入細(xì)胞的短蛋白序列（ECS）（Thomma H J，2011）。第七類 R 基因 TIR-NBS-LRR-NLS-WAKY，該類蛋白除了含有 TINBS-LRR 結(jié)構(gòu)外，在其 C 端還有一個核定位信號肽，N 端有一個由 60 個氨酸組成的 WRKYGQK 保守結(jié)構(gòu)域以及一個類似鋅指序列的結(jié)構(gòu)（Deslandes 2003；2002）。第八類 R 基因酶促 R 基因，這類基因沒有 LRR 和 NBS 結(jié)構(gòu)，如人類發(fā)現(xiàn)的第一個植物抗病基因玉米抗玉米圓斑病基因 Hm1，它編碼一種 H四肽毒素還原性酶（Toxinreductase），該酶能有效降解病原菌所產(chǎn)生的毒素從起到抗圓斑病的功效（Gurmukh and Steven， 1992），此外還有大麥的抗銹病因 Rpg1 編碼的一種不含膜定位結(jié)構(gòu)含兩個串聯(lián)蛋白的受體激酶（BrueggemanR2002）。（圖 1-2）

圖 1-3 Mlo 基因家族的常見拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)（Devoto et al，1999）Fig.1-3 A common scaffold topology for the Mlo family3. Mlo 基因的抗病機(jī)制隨著對 Mlo 基因研究的不斷加深，越來越多的研究證明野生型 Mlo 是防衛(wèi)機(jī)制的負(fù)調(diào)控基因子，在已有的研究中表明 Mlo 基因負(fù)向調(diào)控植應(yīng)，Mlo 基因家族的成員在調(diào)節(jié)植物細(xì)胞死亡的過程中起著至關(guān)重要的üschges et al， 1997； Piffanelli et al， 2002），同時也是大麥中白粉病寄主細(xì)胞的必須蛋白（Panstruga， 2005），而其變體 mlo 基因在多種植、葡萄、小麥、水稻等中都表現(xiàn)出對白粉病的非小種廣譜性抗性，這說明與 Mlo 基因在功能上互補(bǔ)。對 mlo 基因抗病機(jī)制的研究主要集中在五解除植物細(xì)胞過敏性壞死，與 Ror 基因抗病的關(guān)系，與鈣調(diào)素（CAM）與 G 蛋白偶聯(lián)受體蛋白功能的關(guān)系，乳突結(jié)構(gòu)與 mlo 基因的抗病功能當(dāng)病原菌入侵植物活體組織時，寄主植物在感病部位會迅速誘導(dǎo)局部的，這種反應(yīng)叫做過敏反應(yīng)（HR）。細(xì)胞過敏性壞死一直被認(rèn)為是植物抗

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2820742