纖維素是植物細胞壁的主要組成部分,是地球上最豐富的可再生資源,在當前世界面臨著能源危機和環(huán)境壓力的情況下,如何更加有效地發(fā)揮微生物纖維素酶的作用來分解和轉化自然界中儲存巨大的纖維素成為能源物質,對解決資源、環(huán)境問題以及人類社會的可持續(xù)發(fā)展具有重大的現(xiàn)實意義,其中定點突變技術已成為人們改善纖維素酶活性的重要技術。嗜熱革節(jié)孢是一種嗜熱真菌,能夠產生較強熱穩(wěn)定性和較高活力的酶,是纖維素的分解者之一。本研究意在尋找影響嗜熱革節(jié)孢第十二家族糖苷水解酶活性的氨基酸位點,通過定點突變技術研究第十二家族糖苷水解酶催化作用機理,同時為尋找使酶活性得到提高和酶學性質得到改善的其余氨基酸位點打下基礎。本研究對來自嗜熱革節(jié)孢第十二家族糖苷水解酶基因steg1進行克隆,得到的cDNA全長為711bp,編碼了237個氨基酸。將目的基因轉化畢赤酵母中誘導表達并純化蛋白,經SDS-PAGE分析,結果顯示STEG1蛋白分子量大小為26kDa,與理論值27kDa大小基本一致。研究發(fā)現(xiàn)嗜熱革節(jié)孢第十二家族糖苷水解酶STEG1三維結構的催化結構域是由18種氨基酸組成的一個凹槽形狀的活性通道,這十八種氨基酸包括F220、P146、Y145、I144、D72、W137、W37、I147、N35、M135、V74、E133、D116、M171、N168、F118、Y77、W128。通過對STEG1結構的分析,發(fā)現(xiàn)纖維素酶在降解纖維素過程中會形成不同的結構,其中在與多種糖類物質反應過程中,位于活性通道上的部分氨基酸位點和葡糖基之間更易形成氫鍵,這些氨基酸位點更易與底物結合反應,Y145的-COOH及氨基酸主鏈上的N與葡糖基的-OH之間形成的氫鍵距離都很近。所以本研究合理選擇了位于催化活性通道上的六個氨基酸位點(N35、W37、Y77、W128、Y145、N168)進行定點突變,得到了八種突變酶(N35Q、W37H、Y77F、W128S、Y145F、Y145A、Y145W、N168Q),經測定這八種突變酶的酶學性質各發(fā)生了不同的變化。研究結果顯示,與原酶WT相比,所有突變酶的活性降低,突變酶Y77F和N35Q的熱穩(wěn)定性得到提高。其中突變酶Y77F、W128S、Y145A的K_m值和k_(cat)值都降低;N35Q的K_m和k_(cat)值都升高;突變酶W37H、Y145F、Y145W、N168Q的K_m值升高,k_(cat)值降低。原酶與突變酶的最適pH為5.0,均保持不變。突變酶Y77F、N35Q的最適溫度降低到50℃,WT和突變酶W37H、W128S、Y145A、Y145F、Y145W、N168Q的最適溫度為55℃。研究結果表明這六種氨基酸在第十二家族糖苷水解酶降解纖維素過程中發(fā)揮著重要的作用。
【學位單位】：山東農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：Q936;Q78
【部分圖文】：

溶液轉移至 HiBind DNA Mini 吸附柱中，一次加入的量 10000rpm 離心 1min。掉廢液，重復步驟（4），直到所有的樣品都轉移至吸附入 300μL 的 Binding Buffer（XP2），在室溫條件下以 1掉廢液，重復操作（6）。掉廢液，加入 700μL 的 SPW Wash Buffer，在室溫條件下（注意：SPW Wash Buffer 在使用前用 100%的酒精稀釋。掉廢液，重復操作（8）。3000rpm 空轉吸附柱 2min，然后放在超凈操作臺 2~5min吸附柱放入干凈的 1.5mL 離心管中，加入 15~30μL ddH2O3000rpm 離心 1min，測濃度。STEG1 酵母工程菌的獲得

嗜熱革節(jié)孢第十二家族糖苷水解酶的定點突變下分離膠，用染色液染色后用脫色液族糖苷水解酶 STEG1 突變體的真核得基酸序列提交 SWISS-MODEL 得到H12 內切葡聚糖酶的晶體結構（PD級結構的活性通道由 18 種氨基酸（Trp37、Ile147、Asn35、Met135、8、Tyr77、Trp128）組成，本研究選p37、Trp128、Tyr145、Asn168）進

族糖苷水解酶 STEG1列分析行提取總 RNA，反轉錄得顯示，嗜熱革節(jié)孢第十二家成，從圖 3-1 看中出片段大 WT 基因序列與 GenBank冊序列為灰腐質第十二家族析可得，兩段基因不同之處 C、第 464 位堿基 C、第 60、第 429 位堿基 C、第 51

【參考文獻】

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本文編號：2818412