本研究以野生型煙草NC89和轉(zhuǎn)入堿蓬脫水素基因的煙草(DHN-1、DHN-2、DHN-3、DHN-4)為實(shí)驗(yàn)材料,通過(guò)Western blot技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù),對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因材料進(jìn)行了分子水平的檢測(cè),同時(shí)對(duì)溫度和鹽等逆境脅迫條件下,轉(zhuǎn)基因煙草中外源基因的表達(dá)及植株的生理生化水平進(jìn)行了研究和探索,以揭示脫水素基因在植物中的抗逆機(jī)制。研究結(jié)果如下:1.以盤錦紅海灘的翅堿蓬為陽(yáng)性對(duì)照,以野生型煙草為陰性對(duì)照,應(yīng)用Western blot技術(shù)對(duì)PCR陽(yáng)性的DHN-1、DHN-2、DHN-3、DHN-4四株轉(zhuǎn)基因材料進(jìn)行表達(dá)水平的檢測(cè)。結(jié)果顯示,四株轉(zhuǎn)基因煙草均為陽(yáng)性,表明外源脫水素基因在煙草中成功表達(dá)了脫水素蛋白。2.通過(guò)qRT-PCR技術(shù),分別測(cè)定低溫和鹽脅迫條件下,轉(zhuǎn)基因煙草的根和葉中脫水素基因的表達(dá)量。結(jié)果分析顯示低溫脅迫條件下,四個(gè)轉(zhuǎn)基因植株中Ss DHN基因均上調(diào),但是DHN-1葉片中脫水素基因表達(dá)量在處理12 h時(shí)最高,DHN-2、DHN-3、DHN-4葉片中脫水素基因表達(dá)量在處理時(shí)間為24 h達(dá)到最高點(diǎn),而DHN-1根中脫水素基因表達(dá)量在處理24 h時(shí)最高,DHN-2、DHN-3、DHN-4根中脫水素基因表達(dá)量在處理時(shí)間為12 h時(shí)最高;鹽脅迫結(jié)果表明,四個(gè)轉(zhuǎn)基因植株中SsDHN基因均上調(diào),DHN-1葉片中脫水素基因表達(dá)量在NaCl濃度為100 mM時(shí)最高,DHN-2葉片中脫水素基因表達(dá)量在NaCl濃度為200 mM時(shí)最高,DHN-3和DHN-4葉片中脫水素基因表達(dá)量在Na Cl濃度為300 mM達(dá)到最高點(diǎn),而DHN-1、DHN-2、DHN-3和DHN-4根中脫水素基因表達(dá)量均在NaCl濃度為300 m M時(shí)最高。3.通過(guò)對(duì)野生型煙草和轉(zhuǎn)脫水素基因煙草在不同鹽濃度MS培養(yǎng)基上發(fā)芽率及根長(zhǎng)的統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn),相同鹽濃度下,轉(zhuǎn)基因煙草的發(fā)芽率高于野生型煙草,且通過(guò)對(duì)比根長(zhǎng)發(fā)現(xiàn),無(wú)鹽的MS培養(yǎng)基培養(yǎng)的野生型煙草根的伸長(zhǎng)長(zhǎng)于轉(zhuǎn)基因煙草,但在相同鹽濃度下對(duì)比,轉(zhuǎn)基因煙草的根長(zhǎng)長(zhǎng)于野生型,說(shuō)明SsDHN基因能夠提高煙草的耐鹽能力;且在200 m M Na Cl濃度下,野生型煙草和轉(zhuǎn)基因煙草葉片均出現(xiàn)皺縮現(xiàn)象,將苗轉(zhuǎn)移至正常培養(yǎng)基,轉(zhuǎn)基因煙草6 d后葉片恢復(fù)正常而野生型煙草則10 d恢復(fù)。4.分別測(cè)定不同鹽濃度處理下,野生型煙草和轉(zhuǎn)基因煙草葉片和根部的K~+和Na~+含量發(fā)現(xiàn),不同Na Cl濃度處理下,轉(zhuǎn)基因煙草中K~+的含量呈增加的趨勢(shì),且轉(zhuǎn)基因煙草DHN3在鹽脅迫下K~+的含量均高于野生型,當(dāng)NaCl濃度為400 mM時(shí),轉(zhuǎn)基因煙草根中的K~+含量趨于0;鹽脅迫條件下轉(zhuǎn)基因煙草中Na~+的含量比正常條件下高,但是相同濃度NaCl處理下,轉(zhuǎn)基因煙草中Na~+的含量低于野生型;說(shuō)明Ss DHN基因能夠維持細(xì)胞內(nèi)K~+和Na~+的平衡,而使植物免受離子毒害作用。
【學(xué)位單位】：沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：Q943.2
【部分圖文】：

設(shè)置曝光時(shí)間為 20 s，運(yùn)行，獲取圖片，保存圖片。與分析質(zhì)定量結(jié)果準(zhǔn)曲線的繪制準(zhǔn)溶液的吸光值如下表：表 2-5 標(biāo)準(zhǔn)蛋白的濃度及吸光值Table 2-5 Standard protein concentration and absorbance values溶液 BSA 含量（μL） 標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（μg/μL） 吸光值0 0 0100 0.121 0.395200 0.204 0.628300 0.292 0.875400 0.420 1.232500 0.483 1.409白濃度為橫坐標(biāo)、吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如下：

Table 2-6 Sample absorbance and protein concentration樣品編號(hào) 吸光值 蛋白濃度（μg/μL）CK+1.578 0.543CK-1.106 0.375DHN-1 1.469 0.504DHN-2 1.493 0.513DHN-3 1.309 0.447DHN-4 1.521 0.523其中 CK+為堿蓬，CK-為野生型煙草，DHN-1—DHN-4 為轉(zhuǎn)基因煙草。 聚丙烯酰胺凝膠電泳分析根據(jù)計(jì)算出的各個(gè)蛋白濃度，以 15 μg 蛋白上樣量計(jì)算上樣的體積進(jìn)行 SDS電泳。為了驗(yàn)證克隆所得的預(yù)測(cè)其平均蛋白分子量理論值為 27 KDa 的 SsD經(jīng)過(guò) SDS-PAGE 電泳，考馬斯亮藍(lán)染色后，在陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和轉(zhuǎn)基 kDa 處均有清晰的蛋白條帶，說(shuō)明脫水素蛋白可能在轉(zhuǎn)基因煙草中成功表步驗(yàn)證 27 KDa 處的蛋白是否為脫水素蛋白，接下來(lái)進(jìn)行 Western blot。

Westernblot雜交圖

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前7條

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本文編號(hào)：2808718