目的:肝癌是一種惡性程度較高,治愈率低的臨床常見的惡性腫瘤,居全球惡性腫瘤發(fā)病率的第四位,病死率的第三位。目前采用包括如手術(shù)、放療、化療、分子靶向療法、肝動(dòng)脈化療栓塞以及中醫(yī)治療等手段治療肝癌,其中化療仍是治療中晚期肝癌的重要手段。5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)是晚期肝癌化療的主要藥物,但臨床療效仍不樂觀,其失敗的主要原因在于肝癌獲得性耐藥性的產(chǎn)生。因此,深入研究5-FU在肝癌細(xì)胞中的耐藥機(jī)制具有重要臨床意義。近年來,隨著基因重組技術(shù)與分子生物學(xué)理論的成熟,有關(guān)肝癌耐藥基因的研究不斷涌現(xiàn),這其中化療聯(lián)合基因治療突現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。相關(guān)研究報(bào)道ATAD2基因與5-FU的化療效果密切相關(guān),而ATAD2基因是一種與腫瘤密切相關(guān)的原癌基因,位于染色體8q24.13其表達(dá)產(chǎn)物ATAD2又稱ANCCA,在低分化組織或惡性腫瘤組織中高表達(dá),而在分化成熟組織中低表達(dá)或不表達(dá)。本研究通過利用crispr/cas9基因敲除技術(shù)將ATAD2基因敲除,進(jìn)而觀察肝癌細(xì)胞對(duì)5-FU的敏感性變化并初步探討其機(jī)制作用。研究方法:本研究選用肝癌Huh7細(xì)胞和HCCLM3細(xì)胞作為研究對(duì)象,通過crispr/cas9基因敲除技術(shù)將ATAD2基因敲除,建立ATAD2基因沉默的單克隆細(xì)胞系即Huh7-sh-ATAD2與HCCLM3-sh-ATAD2。Western blot的方法檢測(cè)Huh7-sh-ATAD2細(xì)胞和HCCLM3-sh-ATAD2細(xì)胞ATAD2的蛋白表達(dá)情況。利用CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度5-FU在48h和72h作用下對(duì)Huh7-sh-ATAD2及HCCLM3-sh-ATAD2細(xì)胞及其陰性對(duì)照細(xì)胞增殖抑制作用的差異和特征規(guī)律,并繪制相應(yīng)的作用曲線。通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)5-FU處理后的細(xì)胞進(jìn)行周期和凋亡的檢測(cè)。通過Western blot的方法檢測(cè)5-FU處理的癌細(xì)胞和未處理的癌細(xì)胞中GLi1的蛋白表達(dá)情況。結(jié)果:1經(jīng)Western blot技術(shù)檢測(cè)顯示:敲除ATAD2基因的肝癌Huh7細(xì)胞和HCCLM3細(xì)胞,ATAD2蛋白不表達(dá),ATAD2基因沉默穩(wěn)定細(xì)胞系成建立成功。2 CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)表明:1)5-FU作用于Huh7-sh-ATAD2細(xì)胞,HCCLM3-sh-ATAD2細(xì)胞,Huh-NC細(xì)胞以及HCCLM3-NC細(xì)胞,隨著藥物濃度的增加及作用時(shí)間的延長(zhǎng),各組細(xì)胞增值抑制率逐漸增高。差距具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。2)給予5-FU處理,在相同作用濃度及作用時(shí)間下,Huh7-sh-ATAD2細(xì)胞與Huh-NC,HCCLM3-sh-ATAD2細(xì)胞與HCCLM3-NC相比,細(xì)胞增殖抑制率顯著增高,差距具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。3 Annexin V檢測(cè)細(xì)胞凋亡,結(jié)果顯示:加入5-FU處理后,HCCLM3、Huh-7細(xì)胞干擾組的細(xì)胞凋亡率均明顯高于對(duì)照組,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),提示沉默ATAD2能夠增強(qiáng)5-FU對(duì)HCCLM3、Huh-7細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。4 PI檢測(cè),加入5-FU處理,干擾組與對(duì)照組比較,HCCLM3、Huh-7細(xì)胞易阻滯于S期。5經(jīng)Western blot技術(shù)檢測(cè)顯示,加入5-FU處理后,基因敲除組的Gli1蛋白表達(dá)明顯低于對(duì)照組。初步證實(shí)ATAD2基因敲除后,5-FU的藥敏性增加可能通過Hedgehog信號(hào)通路調(diào)控結(jié)論:1敲除ATAD2基因后,增加了肝癌細(xì)胞Huh7和HCCLM3對(duì)5-FU的敏感性。2敲除ATAD2基因后,肝癌細(xì)胞對(duì)5-FU敏感性增加的機(jī)制可能通Hedgehog信號(hào)通路調(diào)控
【學(xué)位單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R735.7
【部分圖文】：

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文3 結(jié)果3.1 Western blot 檢測(cè) ATAD2 基因敲除效果運(yùn)用 crispr/cas9 技術(shù)敲除人肝癌細(xì)胞 Huh7 和 HCCLM3 的 ATAD2。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞較未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞 ATAD2 的蛋白表達(dá)水平明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05）。表 3.1ATAD2 基因敲除前后灰度值結(jié)果Huh7 Huh7-sh-ATAD2 HCCLM3 HCCLM3-sh-ATAD2灰度值 0.51±0.03 0.11±0.03 0.38±0.03 0.068±0.11

.2 不同 5-Fu 濃度下 Huh7 細(xì)胞和 HCCLM3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染不同時(shí)間的細(xì)胞Huh7 HCCLM3轉(zhuǎn)染48h轉(zhuǎn)染后-48h未轉(zhuǎn)染-72h轉(zhuǎn)染后-72h未轉(zhuǎn)染-48h轉(zhuǎn)染后-48h未-±0.062 0.819±0.074 0.896±0.021 0.824±0.119 0.936±0.055 0.818±0.076 0.896±0.035 0.779±0.040 0.860±0.011 0.798±0.148 0.873±0.021 0.788±0.040 0.859±0.058 0.712±0.087 0.772±0.019 0.652±0.132 0.782±0.044 0.703±0.099 0.772±0.089 0.555±0.070 0.778±0.031 0.550±0.061 0.748±0.041 0.553±0.073 0.761±0.056 0.447±0.031 0.736±0.050 0.360±0.074 0.729±0.060 0.447±0.017 0.688

不同5-Fu濃度下HCCLM3細(xì)胞轉(zhuǎn)染不同時(shí)間的細(xì)胞活力

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 ;Mechanism of 5-fluorouracil required resistance in human hepatocellular carcinoma cell line Bel_(7402)[J];World Journal of Gastroenterology;2002年06期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 王啟宇;Sonic Hedgehog信號(hào)通路活性下調(diào)參與人類肝細(xì)胞癌中5-FU抑癌作用的研究[D];山東大學(xué);2008年

本文編號(hào)：2808359