【摘要】：Bursicon是調(diào)節(jié)昆蟲(chóng)表皮硬化及展翅的激素類(lèi)蛋白,它在昆蟲(chóng)的表皮硬化和翅的伸展過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。本研究克隆獲得煙蚜Myzus persicae(Sulzer)。Bursicon基因(Burs-α和Burs-β)全長(zhǎng)并預(yù)測(cè)其結(jié)構(gòu)和功能,對(duì)這兩個(gè)基因的進(jìn)化地位進(jìn)行分析;通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR(real-time quantitative PCR,q-PCR)技術(shù)研究了Bursicon基因在煙蚜不同發(fā)育階段的表達(dá)特征,最后利用RNA干擾技術(shù)研究Bursicon基因在煙蚜體內(nèi)的功能。相應(yīng)結(jié)果如下:1.煙蚜不同翅型轉(zhuǎn)錄組分析為了豐富煙蚜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)信息,為探明煙蚜翅型分化的分子機(jī)制打下基礎(chǔ)。本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)Illumina HiSeq~(TM) 2000分別檢測(cè)煙蚜若蚜、無(wú)翅成蚜和有翅成蚜轉(zhuǎn)錄組表達(dá)差異;通過(guò)熒光定量PCR方法,分析翅型相關(guān)基因表達(dá)模式。結(jié)果表明:經(jīng)過(guò)測(cè)序獲得質(zhì)量值高于20的堿基比例(Q20)均不低于94%的數(shù)據(jù)(GenBank登錄號(hào):SRR6112438,SRR6112436和SRR6112437);所有reads組裝成128 065個(gè)unigenes,平均長(zhǎng)度607.08 bp;將所得序列注釋到NR,NT,KOG,GO和KEGG等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì),共有128 065個(gè)unigenes被注釋�；虮磉_(dá)分析發(fā)現(xiàn),與無(wú)翅成蚜和若蚜兩者相比,有翅成蚜翅形成、肽類(lèi)激素和受體蛋白相關(guān)基因的表達(dá)量存在顯著差異。qPCR分析結(jié)果顯示,在有翅成蚜與無(wú)翅成蚜中,Bursicon(Bur-α和Bur-β),Flightin(Fln),Wntless(Wnt),Distal-less(Dll),Decapentaplegic(Dpp),Juvenile hormone epoxide hydrolase基因(JHEH)和Ecdysone receptor基因(EcR)表達(dá)量存在顯著差異,表明這些基因可能與翅型發(fā)育有關(guān)。2.煙蚜Bursicon基因全長(zhǎng)序列的獲得利用RT-PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)和cDNA末端快速擴(kuò)增(rapid-amplification of cDNA ends,RACE)技術(shù)進(jìn)行Bursicon基因進(jìn)行全長(zhǎng)擴(kuò)增,序列經(jīng)過(guò)DNAstar 5.0拼接得到848 bp Burs-α(GenBank登錄號(hào):MF083566)全長(zhǎng)cDNA序列和841 bp Burs-β(GenBank登錄號(hào):MF083567)全長(zhǎng)cDNA序列,將其分別命名為Mpburs-α和Mpburs-β。分析表明,Mpburs-α全長(zhǎng)cDNA序列擁有一個(gè)完整483 bp的開(kāi)放閱讀框(ORF),共編碼160個(gè)氨基酸,5端非編碼區(qū)(5'-UTR)63 bp,3端非編碼區(qū)(3'-UTR)302 bp,具有真核生物典型加尾信號(hào)(AATAAA)和polyA結(jié)構(gòu);Mpburs-β的全長(zhǎng)cDNA序列擁有一個(gè)完整417 bp的開(kāi)放閱讀框(ORF),共編碼138個(gè)氨基酸,5端非編碼區(qū)(5'-UTR)124bp,3端非編碼區(qū)(3'-UTR)300 bp,同樣具有典型的加尾信號(hào)(AATAAA)和polyA結(jié)構(gòu)。3.煙蚜Bursicon基因生物信息學(xué)分析對(duì)Mpburs-α和Mpburs-β基因全長(zhǎng)序列分析,對(duì)Mpburs-α和Mpburs-β基因編碼的氨基酸及蛋白質(zhì)進(jìn)行理化性質(zhì)和高級(jí)結(jié)構(gòu)的生物信息學(xué)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析,結(jié)果如下:Mpburs-α和Mpburs-β的相對(duì)分子量分別約為17.59 kDa和15.45 kDa,分別由2424個(gè)和2148個(gè)原子組成,估測(cè)理論等電點(diǎn)pI分別為7.96和4.84,化學(xué)分子式分別為C_(759)H_(1204)N_(210)O_(232)S_(19)和C_(672)H_(1072)N_(180)O_(212)S_(12);Mpburs-α和Mpburs-β的氨基酸序列與豌豆蚜Acyrthosiphon pisum和麥雙尾蚜Diuraphis noxia鞣化激素氨基酸序列一致性最高;Mpburs-α和Mpburs-β基因均有沒(méi)有跨膜區(qū),但都具有信號(hào)肽和磷酸化位點(diǎn);分子系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明,煙蚜與豌豆蚜和麥雙尾蚜親緣關(guān)系較近。4.煙蚜Bursicon基因不同齡期表達(dá)分析利用熒光定量PCR技術(shù)分析煙蚜在不同發(fā)育時(shí)期(1齡若蟲(chóng)至剛羽化的成蟲(chóng))的Mpburs-α和Mpburs-β基因的表達(dá)模式。結(jié)果顯示,Mpburs-α和Mpburs-β基因在煙蚜不同發(fā)育階段表達(dá)量不同。其中1齡若蚜表達(dá)量最高,4齡若蚜最低。有翅型1日齡成蚜與無(wú)翅型相比,Mpburs-α和Mpburs-β基因在有翅型成蚜中表達(dá)量均顯著高于無(wú)翅型成蚜。5.煙蚜Bursicon基因功能分析分別用dsburs-α、dsburs-β和Pbs飼喂煙蚜2齡若蟲(chóng),觀察記錄表型變化和死亡率,72 h后收集部分蟲(chóng)體檢測(cè)靶標(biāo)基因在煙蚜體內(nèi)表達(dá)情況。結(jié)果顯示,與飼喂Pbs相比,飼喂dsburs-α和dsburs-β后,Burs-α基因和Burs-β基因在煙蚜體內(nèi)的表達(dá)水平分別下降了67.54%和50.46%,說(shuō)明Burs-α基因和Burs-β基因的表達(dá)明顯被抑制。死亡率統(tǒng)計(jì)及表型觀察發(fā)現(xiàn):當(dāng)飼喂dsMpburs的最終濃度為15 ng/μl,72h時(shí)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的死亡率沒(méi)有明顯差異,但表皮的顏色異常,由紅褐色變?yōu)榈G色或透明狀,表皮黑化程度明顯降低。說(shuō)明飼喂dsMpburs基因后煙蚜表皮鞣化和黑化作用受到抑制。本文通過(guò)煙蚜轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、設(shè)計(jì)特異性引物、RT-PCR技術(shù)、RACE技術(shù)成功獲得了煙蚜鞣化激素-α和鞣化激素-β基因全長(zhǎng)序列,并利用熒光定量PCR以及RNAi技術(shù),研究了它們?cè)跓熝敛煌l(fā)育時(shí)期的表達(dá)量變化情況以及在煙蚜生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中所起的作用,以期為進(jìn)一步研究煙蚜鞣化激素基因的功能打下基礎(chǔ),為研究以鞣化激素為靶標(biāo)的新型防治技術(shù)提供借鑒。
【學(xué)位授予單位】：貴州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：S433.3
【圖文】：

圖 1.1 鞣化激素激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)假想通路 (Ishaaya et al., 2012)Fig 1.1hypothesized Bursicon signaling pathways鞣化激素功能的實(shí)現(xiàn)包括合成和釋放兩個(gè)過(guò)程。Reynolds et al.（1983）使法將昆蟲(chóng)體中樞神經(jīng)系統(tǒng)各區(qū)段的勻漿液注射到結(jié)扎了的紅頭麗蠅體內(nèi)，果表明，神經(jīng)系統(tǒng)的所有部位均發(fā)現(xiàn)鞣化激素。Taghert（1982a, 1982b）細(xì)胞生物技術(shù)測(cè)定煙草天蛾腹部各節(jié)神經(jīng)細(xì)胞中的鞣化激素含量發(fā)現(xiàn)，每神經(jīng)節(jié)側(cè)面均有 4 個(gè)體積較大的能夠合成和釋放鞣化激素的神經(jīng)細(xì)胞，這被命名為“細(xì)胞 24-27”。在進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)僅“細(xì)胞 27”能合成鞣化激素?zé)煵萏於瓴煌纳L(zhǎng)發(fā)育階段表達(dá)量有較大的差異。Luan 等（2006）在蠅的研究中也得到了相似的結(jié)論。昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)期，鞣化激素只能在腹部神經(jīng) 個(gè)“細(xì)胞 27”中發(fā)現(xiàn)，而到了蛹期的時(shí)候，腹部神經(jīng)節(jié)中能表達(dá)鞣化激素增至 14 個(gè)。研究表明，幾乎所有昆蟲(chóng)的鞣化激素從中樞神經(jīng)系統(tǒng)到血淋放都會(huì)經(jīng)歷一個(gè)短暫激增的過(guò)程。鞣化激素在昆蟲(chóng)神經(jīng)節(jié)中合成后，由神調(diào)控翅伸展成熟 表皮黑化和成熟對(duì)昆蟲(chóng)免疫系統(tǒng)的影響

貴州大學(xué) 2018 屆碩士研究生學(xué)位論文表 2.3 煙蚜轉(zhuǎn)錄組測(cè)序序列組裝質(zhì)量Table 2.3 Assembly quality of Myzus persicae transcriptome范(bp)equencelength總數(shù)Totalnumber≥500bp≥1 000bpN50 長(zhǎng)度(bp)N50length最大長(zhǎng)度(bp)Maximamlength最小長(zhǎng)度(bp)Minimumlength總長(zhǎng)度(bp)Total length平均度Mlen錄本ranscript145 200 46 464 23 317 1 477 118 446 201 107 804 096 74nigene 128 065 33 844 14 164 855 118 446 201 77 745 381 60

圖 2.2 NR 數(shù)據(jù)庫(kù)同源物種分類(lèi)圖Fig. 2.2 Species distribution of homology search of unigenes against the Nr database表 2.4 煙蚜基因注釋結(jié)果統(tǒng)計(jì)Table 2.4 Annotation of unigenes of Myzus persicae數(shù)據(jù)庫(kù)Database注釋的 unigenes 數(shù)目Number of annotatedunigenes注釋的 unigenes 百分比Percentage of annotatedunigenesCDD 32 823 25.63KOG 27 755 21.67NR 48 403 37.8NT 48 359 37.76PFAM 28 714 22.42Swissprot 39 320 30.7TrEMBL 48 953 38.23GO 40 556 31.67KEGG 19 995 15.61在至少一個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中注釋成功

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2803671