【摘要】：β-酮脂酰-ACP合成酶II(KASII)在質(zhì)體內(nèi)催化16:0-ACP生成18:0-ACP,是植物細(xì)胞中決定16C和18C脂肪酸比例的關(guān)鍵酶,亦是植物油脂代謝工程一個(gè)重要靶標(biāo)。栽培陸地棉(Gossypiumhirsutum Linn)是集纖維、油脂和蛋白質(zhì)為一體的重要經(jīng)濟(jì)作物,其基因組為異源四倍體(AADD)。有關(guān)棉花GhKASII酶蛋白特性、基因結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能的研究還未見詳盡報(bào)道。基于陸地棉基因組數(shù)據(jù),本文對(duì)棉花GhKASII家族進(jìn)行全基因組鑒定,分析GhKASII家族各成員酶蛋白的理化特性和基因結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)進(jìn)化,檢測GhKASII基因家族各成員的時(shí)空表達(dá)特征,并通過異源表達(dá)鑒定各成員的生物學(xué)功能。研究將豐富對(duì)植物種子油脂生物合成及調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識(shí),為應(yīng)用基因工程改良棉花油脂品質(zhì)及產(chǎn)量提供科學(xué)依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:(1)陸地棉全基因組鑒定共獲得21個(gè)GhKASII家族成員,酶蛋白質(zhì)的氨基酸長度介于152～580 aa之間,分子量為62.34 kDa～16.67 kDa。酶蛋白可分為親水穩(wěn)定、親水不穩(wěn)定、疏水穩(wěn)定、疏水不穩(wěn)定等四種類型。組成酶蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)有四種形式,依次出現(xiàn)頻率為:α-螺旋無規(guī)則卷曲延伸直鏈β-轉(zhuǎn)角,其中6個(gè)蛋白成員的α-螺旋結(jié)構(gòu)比例超過50%。21個(gè)GhKASII蛋白成員均沒有信號(hào)肽,絕大部分成員定位于葉綠體中。21個(gè)GhKASII成員系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示該家族可分為三個(gè)亞家族,即GhKASIIA、GhKASIIB 和 GhKASIIC。(2)以GhKASII家族基因的轉(zhuǎn)錄本序列為模板設(shè)計(jì)RT-PCR的引物,定量PCR檢測各GhKASH成員在棉花根、莖、葉、花和胚珠等五個(gè)組織中表達(dá)譜。21個(gè)GhKASII基因成員中,有4個(gè)表達(dá)量極低,12個(gè)中等水平表達(dá),5個(gè)成員在五個(gè)組織中均高量表達(dá),且各成員的表達(dá)存在組織特異性。(3)進(jìn)一步對(duì)五個(gè)高表達(dá)的GhKASII基因定量PCR分析顯示,KASII8\KASII18、KASII21三個(gè)基因在花器官中表達(dá)量最高,KASII13在莖中的表達(dá)量最高,KASII20在葉片中的表達(dá)量最高。這五個(gè)基因表達(dá)量最低的組織分別為莖、葉、胚珠、根和胚珠,最高表達(dá)量分別是最低表達(dá)量的3.12、1.76、3.58、2.91和2.47倍,表達(dá)差異極顯著。就五個(gè)基因的整體表達(dá)水平而言,表達(dá)量最高的是KASH13,表達(dá)量相對(duì)較低的是KASII8和KASII20,這兩個(gè)基因表達(dá)量小于KASII13的50%之多。(4)分別分離五個(gè)高表達(dá)的GhKASII基因,并克隆插入中間載體pBluescript質(zhì)粒。再分別將這五個(gè)GhKASII基因ORF序列連接到表達(dá)載體pCAMBIA1303-N質(zhì)粒,其后轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101。用陽性農(nóng)桿菌侵染本氏煙草(Nicotiana benthamiana)葉片,以期瞬時(shí)表達(dá)目的基因。GhKASII瞬間表達(dá)的煙草葉片用于萃取油脂和GC分析脂肪酸組成。結(jié)果顯示,棕櫚酸含量發(fā)生不同程度下降,硬脂酸含量則呈現(xiàn)不同程度上升,證明這幾個(gè)GhKASII酶蛋白具有較高的KASII酶活性,在異源表達(dá)組織中能行使催化16:0生成18:0的功能。
【學(xué)位授予單位】：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S562
【圖文】：

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本文編號(hào)：2794938