【摘要】：蕓薹生鏈格孢(Alternaria brassicicola(Schw.)Wiltshire)侵染導致的黑斑病是十字花科蔬菜生產上的重要病害之一,在蔬菜的田間生長期和儲藏期均可危害,嚴重影響到該類蔬菜的產量、品質和安全性。但是對于其防控至今還未找到非常有效的措施。分生孢子在真菌的致病過程中起著重要的作用,因此查找蕓薹生鏈格孢的產孢相關基因并對產孢機制進行研究,將有助于深入認識其致病機制,從而為病害的防治提供新的策略。本研究對前期構建的蕓薹生鏈格孢轉化子庫進行了篩選,共得到了19株產孢缺陷突變體,利用Hitail-PCR技術對產孢缺陷突變體的插入位點側翼序列進行克隆,得到了突變體M85的右翼序列,序列分析顯示該右翼序列為酵母轉錄因子Ndt-80同源基因,命名為Abcdm1(A.brassicicola conidiation-deficiency mutant)。對Abcdm1基因進行了克隆和序列分析,同時根據同源重組原理,采用PEG介導的原生質體轉化的方法,獲得1個基因敲除突變體ΔAbcdm1和1個回復突變體C,并進行了生物學功能分析,研究結果如下:對蕓薹生鏈格孢轉化子庫進行了產孢缺陷突變體的篩選,共得到了19株產孢降低的突變體,其中產孢能力完全喪失的有13株,分別M17,M37,M51,M56,M73,M85,M131,M96,M101,M133,M159,M204,M324;產孢能力顯著降低的有6株,為M15,M108,M122,M183,M258,M177。Hitail-PCR得到了M85突變體的右翼序列,為酵母轉錄因子Ndt-80同源基因,命名為Abcdm1。對Abcdm1基因進行了擴增和分析,該基因全長1905 bp,cDNA 1632 bp,編碼543個氨基酸,并發(fā)現該基因與其它真菌同源性較低。Abcdm1基因參與蕓薹生鏈格孢的菌絲生長調控,突變體ΔAbcdm1氣生菌絲變長,呈絨毛狀,菌絲純白,無黑色素,但是突變體菌落生長速度與野生型菌株一致。Abcdm1基因參與調控蕓薹生鏈格孢的產孢,突變體ΔAbcdm1產孢能力完全喪失。Abcdm1基因參與蕓薹生鏈格孢的脅迫調控,突變體ΔAbcdm1對KCl和NaCl敏感性升高,對氧脅迫因子H_2O_2敏感性較低。Abcdm1基因參與體外穿透力的調控,突變體ΔAbcdm1體外穿透能力完全消失,但是致病性與野生型相比無差異。Abcdm1基因參與營養(yǎng)代謝的調控。突變體ΔAbcdm1對碳源和氮源的營養(yǎng)應答的反應不同。在基礎培養(yǎng)基上MM上加入葡萄糖之后,我們發(fā)現突變體幾乎不生長。然而在基礎培養(yǎng)基上加入BSA之后,突變體可以進行生長。綜上所述,在蕓薹生鏈格孢(A.brassicicola)中Abcdm1基因參與脅迫敏感性的應答、營養(yǎng)代謝的應答和體外穿透力。
【學位授予單位】：山東農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S432.4
【圖文】：

圖 1. ΔAbcdm1 突變體篩選驗證相關的引物設計示意圖Fig1. Relative primers locations for Abcdm1 screening verification are indicated on the schematic diagram采用 CTAB 提取轉化子全基因組 DNA。根據同源重組原理分析，設計驗證引物Abcdm1-YF/hph3、hph1/hph2，引物設計原理如圖 1。采用普通 PCR 方法，同時與野生菌對比分析，從而篩選出基因缺失突變體 ΔAbcdm1。2.2.12.3 Southern blot 驗證 Abcdm1 基因缺失轉化子通過 Southern blot 進一步驗證得到的突變體是否是單拷貝。提取野生型菌株和突變菌株的基因組 DNA，經合適的限制性內切酶酶切后進行凝膠電泳，以 hph 引物（hph1/hph2）從質粒 pUCATPH 上擴增 hph 片段（1046 bp）制備探針進行 Southern blot分析。Southern blot 過程參考羅氏地高辛標記及檢測試劑盒操作手冊（DIG High PrimeDNA 標記及雜交檢測試劑盒Ⅱ）。突變體雜交條帶為一條時是正確的轉化子。(1) 基因組 DNA 的酶切

產孢缺陷突變體的篩選Fig.2Screeningofconidiation-deficiencymutantsM258M204M183M324

26圖 3 Hitail-PCR 擴增產物瓊脂糖凝膠電泳分析M1：Marker DL2000 ；M2：Marker 2000 plusFig3. Analysis of PCR products by agarose gel electrophoresisM1: Marker DL2000 ; M2: Marker 2000 plus帶進行回收測序，其中 M85 菌株測序成功，有效因為濃度太低或者測序雙峰而導致測序結果失敗，結果顯示其包括了 603bp 潮霉素磷酸轉移酶載體 側 序 列 的 422 bp 放 入 蕓 薹 生 鏈 格 孢 全 基.gov/Altbr1/Altbr1.home.html）中進行查詢和比對

【參考文獻】

相關博士學位論文 前6條

1 常文嬌;低水平萬古霉素耐藥金黃色葡萄球菌生物膜形成及其調控機制研究[D];安徽醫(yī)科大學;2017年

2 劉智蕾;叢枝菌根真菌提高水稻低溫抗性機制：碳、氮代謝及植物激素的作用[D];中國科學院研究生院（東北地理與農業(yè)生態(tài)研究所）;2015年

3 湯瑩;黃獨和腺梗宧薟內生真菌蕓薹生鏈格孢化學成分及藥理活性研究[D];華中科技大學;2015年

4 侯瑞;禾谷鐮刀菌AREA基因的功能研究[D];西北農林科技大學;2015年

5 魏瑋;盾殼霉產孢和生長相關基因的克隆及功能驗證[D];華中農業(yè)大學;2013年

6 徐后娟;長柄鏈格孢（Alternaria longipes）蛋白激酶基因克隆及功能研究[D];山東農業(yè)大學;2008年

相關碩士學位論文 前5條

1 方迪;盾殼霉氮代謝調控基因cmareA的功能研究[D];華中農業(yè)大學;2017年

2 張文琦;大麗輪枝菌Fungal_trans轉錄因子VdFTF1調控致病性功能研究[D];中國農業(yè)科學院;2017年

3 田萌萌;叢枝菌根真菌吸收同化外源氮產生精氨酸的研究[D];浙江師范大學;2011年

4 周騰勝;稻瘟病菌中XprG蛋白的功能分析[D];福建農林大學;2010年

5 謝紅艷;我國部分區(qū)域鏈格孢屬（Alternaria Nees）真菌的資源調查與形態(tài)和分子鑒定研究[D];貴州大學;2006年

本文編號：2784730