【摘要】：基因表達調(diào)控是生物體正常發(fā)育和生命活動的分子基礎(chǔ),是當今分子生物學研究的中心問題之一。Hox(homeotic genes)是一類古老且廣泛存在于生物體內(nèi)的發(fā)育調(diào)控基因,該類基因功能的缺陷通常導致胚胎期致死或器官的同源異型轉(zhuǎn)化。Hox基因在漫長的生物演化中高度保守,且極少發(fā)生基因復制和擴增現(xiàn)象。有學者發(fā)現(xiàn),在昆蟲中Hox基因發(fā)生過基因復制和擴增現(xiàn)象,特別在鱗翅目昆蟲中發(fā)現(xiàn)pb和zen之間擴增產(chǎn)生一簇(4~15個)具有保守Homeobox結(jié)構(gòu)域的Hox基因簇相關(guān)基因,即Shx(Special homeobox genes)。家蠶是重要的經(jīng)濟昆蟲,已有幾千年的馴養(yǎng)歷史。隨著家蠶全基因組測序的完成和29個家蠶品系基因組重測序數(shù)據(jù)的公布以及轉(zhuǎn)錄組和蛋白組數(shù)據(jù)等的逐漸完善,為家蠶的后基因組研究提供了堅實的基礎(chǔ)。近些年生物技術(shù)快速發(fā)展,在家蠶中利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)對基因功能及基因表達調(diào)控的研究也日益普遍。同時,由于Hox基因具有重要的發(fā)育調(diào)控功能,Shx基因作為鱗翅目昆蟲Hox基因簇擴增產(chǎn)生的新基因具有重要研究價值。本小組對家蠶Shx基因的前期研究中,完成了Shx基因的鑒定和表達模式分析,發(fā)現(xiàn)在家蠶中存在5個Shx基因,即BmshxA、BmshxB1、BmshxB2、BmshxC1和BmshxC2,這5個基因的表達模式高度一致。在幼蟲期它們均只在家蠶卵巢中特異表達,成蟲期僅在雌蛾卵內(nèi)特異表達。原位雜交實驗顯示Bmshx基因特異在幼蟲卵巢和成蟲期卵的濾泡細胞表達,推測其與漿膜發(fā)育有關(guān)。由于Shx這類基因是Hox基因簇中新鑒定到的基因,其對卵巢或卵發(fā)育行使的具體功能及分子調(diào)控機制尚不清楚。本研究選擇家蠶ShxA和ShxC1基因進行研究。首先通過生物信息學、基因克隆和轉(zhuǎn)基因的方法對這兩個基因的啟動子進行鑒定,再利用蛋白與DNA結(jié)合性實驗,釣取與BmshxA基因上游序列特異結(jié)合的反式因子,篩選參與BmshxA基因表達調(diào)控的反式作用因子,并初步探究反式作用因子對BmshxA調(diào)控的分子機制。對家蠶Shx基因的研究,可為研究Hox基因簇新基因的功能、昆蟲卵巢及卵子發(fā)育的調(diào)控機制提供重要參考。本文主要研究結(jié)果如下:1.家蠶ShxA、ShxC1基因啟動子鑒定通過生物信息學對BmshxA、BmshxC1基因潛在的啟動子序列進行轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點預測和分析,然后截取BmshxA基因起始密碼子上游934 bp和1619 bp以及BmshxC1基因起始密碼子上游1656 bp的DNA序列為候選啟動子片段,構(gòu)建三個候選啟動子片段驅(qū)動紅色熒光蛋白基因(DsRed)的piggybac轉(zhuǎn)基因表達載體。在家蠶野生型品系大造的胚胎早期進行顯微注射,孵化后飼養(yǎng)、傳代和篩選轉(zhuǎn)基因陽性個體,最終得到標記為BmshxA-934、BmshxA-1619、BmshxC1-1656的三個轉(zhuǎn)基因系。進一步對轉(zhuǎn)基因系插入位點進行分析,未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因片段插入基因外顯子而導致基因結(jié)構(gòu)和功能破壞的情況。對轉(zhuǎn)基因個體進行觀察,未發(fā)現(xiàn)其在取食、運動及交配產(chǎn)卵過程中存在異常。為了分析截取的候選啟動子的活性,我們調(diào)查轉(zhuǎn)基因個體卵巢中紅色熒光蛋白基因DsRed的表達情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)其在mRNA水平和蛋白水平均能被檢測到,這表明截取的BmshxA-934、BmshxA-1619、BmshxC1-1656片段具有啟動子活性。進一步,我們比較了BmshxA-934和BmshxA-1619片段的啟動效率,發(fā)現(xiàn)BmshxA-1619的啟動效率顯著高于BmshxA-934,暗示BmshxA基因起始密碼子上游935-1619 bp可能含有增強基因表達的元件或反式因子結(jié)合位點。2.家蠶ShxA基因上游反式作用因子篩選和功能研究由于轉(zhuǎn)基因系中BmshxA-934和BmshxA-1619片段啟動DsRed基因表達的活性存在顯著差異,結(jié)合對截取的啟動子序列轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的預測分析,我們選取BmshxA基因起始密碼子上游1344 bp至1626 bp共282 bp為探針,通過DNA pull down實驗釣取與探針結(jié)合的反式因子,對DNA pull down洗脫液進行電泳檢測發(fā)現(xiàn)實驗組和對照組有兩條差異條帶,對差異條帶進行質(zhì)譜鑒定和分析,在實驗組鑒定到8個與探針特異結(jié)合的蛋白,對這8個蛋白進行功能注釋,調(diào)查這8個蛋白編碼基因的表達模式并分析其與BmshxA基因同時期表達模式的相關(guān)性。篩選得到兩個表達極相關(guān)的基因,分別編碼復制蛋白A大亞基和核轉(zhuǎn)運蛋白α亞基。為進一步探究編碼復制蛋白A大亞基和核轉(zhuǎn)運蛋白α亞基基因?qū)mshxA基因的表達調(diào)控機制,我們在剛化蛹時期,利用靶向的雙鏈RNA對這兩個基因進行干涉實驗,檢測干涉目的基因的表達和BmshxA基因的表達情況。干涉編碼復制蛋白A大亞基基因,在該基因表達下調(diào)個體中檢測BmshxA基因的表達存在下調(diào)現(xiàn)象;干涉核轉(zhuǎn)運蛋白α亞基基因,檢測該基因表達有下調(diào),并檢測到BmshxA基因表達顯著上調(diào),暗示核轉(zhuǎn)運蛋白α亞基基因可能對BmshxA基因表達有抑制作用。在本研究中,我們成功構(gòu)建了BmshxA-934、BmshxA-1619、BmshxC1-1656三個轉(zhuǎn)基因系,并證明截取的三個片段均具有啟動基因表達的活性。利用DNA pull down和質(zhì)譜技術(shù)鑒定得到與BmshxA基因上游序列結(jié)合的8個蛋白,其中重點關(guān)注兩個蛋白即復制蛋白A大亞基和核轉(zhuǎn)運蛋白α亞基,對這兩個蛋白編碼基因進行雙鏈干涉,發(fā)現(xiàn)核轉(zhuǎn)運蛋白α亞基可能是BmshxA基因的負調(diào)控因子,抑制BmshxA基因的表達,可能參與調(diào)控BmshxA對卵巢或卵的發(fā)育。
【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：Q78;S881.2
【圖文】：

圖 1.1 簡單真核生物和后生動物啟動子比較[2]a 簡單真核生物轉(zhuǎn)錄單元；b 后生動物轉(zhuǎn)錄控制模塊。 1.1 Comparison of a simple eukaryotic promoter and extensively diversified meregulatory modules[2]a. Simple eukaryotic transcriptional unit. b. metazoan transcriptional control modules.序列包含啟動子近端元件（promoter Proximal element）、上游激am activator sequence, UAS）、增強子（enhance）、沉默子（silencsulator）等[4]。啟動子近端元件顧名思義是緊鄰啟動子的一段 DN質(zhì)結(jié)合招募增強子至核心啟動子區(qū)從而調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄[8, 9]。在在類似增強子作用的元件即上游激活序列，其位于啟動子 TATA錄激活因子而使啟動子具有某專一性轉(zhuǎn)錄激活能力[4]。增強子長00 bp 之間，與結(jié)合蛋白作用，可增強基因的轉(zhuǎn)錄。增強子增強向性和位置性，既可以作用于上游的靶基因，也可以作用于下游靶靶基因內(nèi)含子區(qū)域，也可位于靶基因幾百萬堿基對之外[10]。且調(diào)控多個基因的表達，一個基因也可同時受多個增強子調(diào)控，靶

西南大學碩士學位論文基因轉(zhuǎn)錄有較強激活作用的CAAT框，其保守序列為GGCT-CAATCT，若游存在 CAAT 框可大幅提高基因表達；GC 框主要位于轉(zhuǎn)錄起始位-23 bp 處，可結(jié)合調(diào)節(jié)蛋白 SP1[34]。這些 DNA 序列即為核心啟動子上動子依據(jù)其調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的模式可分為 3 類：（1）組成型啟動子（consoter），該類啟動子調(diào)控的基因廣譜性地在所有組織中表達，其表達模式境的影響很小，且在各組織器官和各發(fā)育階段表達量基本保持恒定，如蛋白啟動子[35]；（2）組織特異型啟動子（tissue-specific promoter），是指在特定組織表達的啟動子，可使目的基因表達產(chǎn)物在一定組織部位中積發(fā)育調(diào)節(jié)的特性，如昆蟲生殖細胞特異表達的 vasa 啟動子[36]；（3）誘（inducible promoter），其在某些特定的物理或化學信號的誘導下可大基因的轉(zhuǎn)錄水平，沒有被誘導時基因表達水平很低甚至不表達，如熱休高溫誘導下表達水平顯著升高[37]。

于染色體近端；而調(diào)節(jié)身體偏后端體節(jié)的基因，位于染色體上偏遠端[49]。在胚胎發(fā)育過程中，Hox 基因的表達按照在基因組染色體上由 3’-5’的順序依次表達，調(diào)控體軸近端的基因也即靠近 3’端的基因先表達，調(diào)控體軸遠端發(fā)育的基因也即靠近 5’端的基因后表達[57]。2）后部優(yōu)勢（posterior prevalence）調(diào)控。在研究鼠類脊椎骨同源異型轉(zhuǎn)化時研究者認為，體節(jié)形態(tài)可能是由多個 Hox 基因共同作用的結(jié)果，當一些 Hox基因產(chǎn)生突變就會打破這些 Hox基因相對應區(qū)域的調(diào)控，導致表型的異常[58]。為了更好的闡釋脊椎動物肢體形成是怎樣受 Hox 基因的調(diào)控，后部優(yōu)勢這一模型被提出，即 Hox基因在基因組上按 3’-5’的順序排布，越靠后的基因表達更有優(yōu)勢，其能抑制排列靠前基因的表達[59, 60]。3）體節(jié)形成決定性調(diào)節(jié)和劑量效應。在果蠅腹部肢體形成中，Ubx 和 abd-A 基因通過抑制 Distalless 使得腹部肢體不能形成，Hox 基因?qū)w軸和肢體的發(fā)育形成起到?jīng)Q定性作用[61]。劑量效應是在許多基因調(diào)控中均存在的，Hox 基因調(diào)控也存在劑量效應。在鱗翅目昆蟲家蠶中 BmUbx 基因以劑量效應來影響突變體 EKh-l（ Kh-extra-crescents-like ）和 Ecs-l （supernumerary crescents and legs-like）異位長腿的形態(tài)[62, 63]。

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 ;基因的分子生物學(第六版)[J];遺傳;2009年10期

2 Minoru Ozima ,朱炳泉 ,盛乃賢 ,何芝蘭;地球的起源與演化[J];地質(zhì)地球化學;1983年12期

相關(guān)博士學位論文 前1條

1 任剛;轉(zhuǎn)錄因子、染色質(zhì)重塑復合物以及遠程染色質(zhì)相互作用對基因表達調(diào)控的研究[D];西北農(nóng)林科技大學;2015年

本文編號：2771215