【摘要】：14-3-3蛋白是植物細胞內(nèi)蛋白質(zhì)間相互作用的核心,14-3-3蛋白通過與靶蛋白結(jié)合從而調(diào)節(jié)各種生命活動,廣泛參與植物體內(nèi)物質(zhì)運輸、生長發(fā)育、營養(yǎng)代謝、細胞周期、脅迫應(yīng)答及光信號傳導(dǎo)途徑等生理過程的調(diào)控。生物和非生物脅迫刺激不僅改變植物中編碼14-3-3蛋白基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達水平,同時還改變14-3-3蛋白與靶蛋白的相互作用。很多研究證實14-3-3蛋白可通過調(diào)控抗氧化酶基因的表達來影響其活性。此外,14-3-3蛋白還通過與代謝酶的互作對碳和氮代謝進行調(diào)控。植物體內(nèi)14-3-3蛋白由多基因編碼,不同14-3-3基因在功能上有其特異性。因此,要考察植物體內(nèi)不同14-3-3基因的功能時不僅要分析14-3-3基因的表達水平,還需要考察14-3-3蛋白調(diào)控靶蛋白表達水平的變化。目前在科研和診斷中檢測基因轉(zhuǎn)錄水平多采用RT-PCR,檢測蛋白表達水平多采用Western Blot,但這些方法都存在著各自的不足,熒光定量PCR儀在使用過程中運行成本較高,無論是儀器還是耗材的成本都不低;Western Blot分析方法在操作時往往存在操作繁瑣、檢測限低等不足。電化學分析方法具有選擇性好、樣品不需預(yù)處理、可實現(xiàn)連續(xù)在線監(jiān)測、測定成本遠低于大型分析儀器等優(yōu)點。本論文構(gòu)建高靈敏性的電化學DNA傳感器和電化學免疫傳感器,對本實驗室之前獲得的轉(zhuǎn)基因煙草中14-3-3c和14-3-3g及其調(diào)控靶蛋白基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達水平進行分析,考察14-3-3c和14-3-3g在煙草應(yīng)答甲醛脅迫中的作用,主要研究結(jié)果如下:1、基于堿基互補配對原理利用絲網(wǎng)印刷電極構(gòu)建DNA傳感器,通過殼聚糖把碳納米管和單鏈DNA探針固定在工作電極表面,在適宜的條件下與溶液中的互補序列進行雜交形成雙鏈DNA,然后利用電化學方法檢測雜交前后的電化學信號的變化,檢測不同濃度的目標序列。結(jié)果說明目標序列濃度在0.5-1μmol/L范圍內(nèi)時,DPV曲線的峰電流值與目標序列濃度呈良好的線性關(guān)系,線性回歸方程為y=-8.225x+34.84(R2=0.836)。從轉(zhuǎn)基因煙草葉片中提取總RNA,與電極片上的單鏈DNA探針進行雜交反應(yīng),檢測14-3-3c和g基因的轉(zhuǎn)錄水平,結(jié)果說明與WT相比,14-3-3c(ic4)和14-3-3g(ig2)的RNAi干擾表達植株中這兩個基因的轉(zhuǎn)錄水平分別下降62.5%和67.4%;14-3-3c(kc1)和14-3-3g(kg2)的過量表達植株中14-3-3c和g基因的轉(zhuǎn)錄水平分別上升46.5%和36.8%。這個結(jié)果與RT-PCR分析結(jié)果相一致,使用該方法進行檢測時,無需將所提的RNA反轉(zhuǎn)成cDNA,相比RT-PCR節(jié)約了時間和成本。2、基于抗原和抗體間的高度特異性結(jié)合的原理,利用絲網(wǎng)印刷電極構(gòu)建14-3-3蛋白的電化學免疫傳感器,實現(xiàn)14-3-3蛋白的定量檢測。在64 ng/m L到2000ng/ml濃度區(qū)間,IT曲線的電流峰值與14-3-3蛋白濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,線性回歸方程為:y=1.0113x+582.34(R2=0.9986),而Western Blot分析檢測限只能達到μg/ml級別。利用14-3-3蛋白的電化學免疫傳感器對轉(zhuǎn)基因煙草中14-3-3蛋白表達水平進行定量檢測,結(jié)果說明與WT相比,在ic4和ig2植株中14-3-3c和g蛋白的表達量分別下降54.7%和23.7%;在kc1和kg2植株中14-3-3c和g蛋白的表達量分別上升27.7%和27.8%。檢測結(jié)果與傳統(tǒng)的Western Blot方法檢測結(jié)果相一致,但該方法靈敏度高、成本低且耗時少。3、利用電化學DNA傳感器對14-3-3轉(zhuǎn)基因煙草葉片抗氧化酶和甲醛代謝相關(guān)酶基因的轉(zhuǎn)錄水平進行定量分析,結(jié)果說明與WT相比,在14-3-3c和g的干擾表達植株中,APX轉(zhuǎn)錄水平分別上升28.4%和24.8%;CAT轉(zhuǎn)錄水平分別上升30.1%和25.7%;MnSOD轉(zhuǎn)錄水平分別上升17.7%和12.9%;Cu/ZnSOD轉(zhuǎn)錄水平分別上升7.4%和4.6%;POD轉(zhuǎn)錄水平分別上升12.9%和8.6%。14-3-3c和g的干擾表達植株中APX轉(zhuǎn)錄水平分別下降48.6%和15.9%;CAT轉(zhuǎn)錄水平分別下降85.5%和25.9%;MnSOD轉(zhuǎn)錄水平分別下降81.6%和51.8%;Cu/ZnSOD轉(zhuǎn)錄水平分別下降93.8%和23.2%;POD轉(zhuǎn)錄水平分別下降73.9%和64.2%。蘋果酸脫氫酶和異檸檬酸脫氫酶的轉(zhuǎn)錄水平與野生型相比,沒有顯著性差異,表明14-3-3c和g基因調(diào)控煙草甲醛代謝途徑可能不通過轉(zhuǎn)錄水平實現(xiàn)。通過~(13)C-NMR分析結(jié)果證實在甲醛脅迫下14-3-3c的上調(diào)表達使轉(zhuǎn)基因煙草葉片甲醛代謝產(chǎn)生更多的糖類物質(zhì)和氮轉(zhuǎn)運氨基酸,而干擾該基因的表達則抑制糖類物質(zhì)和氮轉(zhuǎn)運氨基酸的合成;干擾14-3-3g的表達抑制甲醛代謝產(chǎn)生糖類物質(zhì),但促進氮轉(zhuǎn)運氨基酸的合成。
【學位授予單位】：昆明理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：Q943.2
【圖文】：

4-3-3蛋白結(jié)構(gòu)示意圖

圖 1.2 植物 14-3-3 蛋白的功能Fig. 1.2 functions of 14-3-3 proteins in plants1.6.2 14-3-3 蛋白調(diào)控靶蛋白的作用機制一般來說，14-3-3 蛋白通過同源二聚體或異源二聚體識別特定的磷酸化絲氨

圖 1.3 14-3-3 蛋白對植物碳代謝和氮代謝的調(diào)控.3 14-3-3 regulation of carbon and nitrogen metabolism i4-3-3 蛋白對植物碳代謝的調(diào)控作用

【參考文獻】

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本文編號：2770018