【摘要】：Wnt信號通路分為經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路和非經(jīng)典Wnt/planar cell polarity(PCP)信號通路。經(jīng)典Wnt信號通路通過促進β-catenin的入核,激活下游靶基因的表達,調(diào)節(jié)細胞命運的決定;而非經(jīng)典Wnt/PCP信號通路引起細胞骨架的重排,調(diào)節(jié)細胞運動。Wnt信號通路在脊椎動物背腹決定,前后圖式形成和形態(tài)發(fā)生運動中發(fā)揮關鍵作用。根據(jù)激活的時間和來源不同,斑馬魚中經(jīng)典Wnt信號通路分為母源Wnt信號通路和合子Wnt信號通路。在囊胚期,母源產(chǎn)物在胚胎預定背部激活了母源Wnt信號通路,調(diào)節(jié)背部和前部命運的決定;在原腸期,合子轉錄的產(chǎn)物在胚胎預定腹部激活了合子Wnt信號通路,調(diào)節(jié)了胚胎腹部和后部的決定。PCP信號通路則對細胞極性的建立是必需的,它的缺陷會造成胚胎集中延伸運動缺陷和頭面部軟骨發(fā)育異常。腳手架蛋白Dishevelled(簡稱Dvls)蛋白同時參與Wnt/β-catenin和Wnt/PCP信號通路。斑馬魚中有5個Dvl蛋白,各個Dvl之間的同源性很高。目前對于每個Dvl如何參與早期胚胎發(fā)育的關鍵過程,人們所知甚少。各個Dvl同源基因以及母源和合子的Dvl如何參與經(jīng)典和非經(jīng)典Wnt信號通路還不清楚。并且因為母源突變體難以得到,Dvl母源產(chǎn)物的功能還是一個謎。本研究中,我們利用基因編輯的手段制作了一系列斑馬魚dvl的母源合子突變體,并檢測了突變體中早期胚胎發(fā)育受到的影響。斑馬魚dvl2和dvl3a的母源產(chǎn)物是泛表達的且表達量高,而其它dvl的表達水平極低,可以忽略,提示dvl2和dvl3a可能在早期胚胎發(fā)育中起主要作用。分別敲除斑馬魚各個dishevelled家族基因,只有MZdvl2突變體表現(xiàn)出明顯的集中延伸缺陷以及頭面部發(fā)育缺陷,MZdvl3a表現(xiàn)出弱的集中延伸缺陷,而MZdvl1a、MZdvl1b、MZdvl3b沒有明顯缺陷,表明dvl2起主導作用。通過構建dvl2和dvl3a的雙突變體,進一步的敲除掉dvl的劑量。dvl2和dvl3a的合子突變體表現(xiàn)出輕微的體軸延伸缺陷,但前后圖式形成正常。Zdvl2;MZdvl3a表現(xiàn)出嚴重的體軸延伸缺陷并開始出現(xiàn)后部的缺陷,但前部發(fā)育正常。通過構建鑲嵌體胚胎,我們克服了合子突變體致死的不利因素,得到了dvl2和dvl3a的母源合子突變體,該突變體表現(xiàn)出嚴重的集中延伸運動缺陷,軀干和后部缺失,同時常常伴隨獨眼和頭面部缺陷。通過表型和分子水平的分析,我們發(fā)現(xiàn)早期的背部決定沒有受到影響,表明dvl2和dvl3a可能并不參與母源Wnt的激活,提示Dishevelled及其上游的經(jīng)典Wnt信號通路組分對于背部決定不是必需的。我們的研究表明母源和合子的dvl2和dvl3a劑量依賴性的調(diào)節(jié)合子Wnt信號通路和Wnt/PCP信號通路的激活,其中dvl2起主導作用。但完全缺失dv12和dv13a的母源合子產(chǎn)物不會對胚胎的背部決定產(chǎn)生影響。本研究有助于我們了解脊椎動物早期胚胎發(fā)育中Dvl介導Wnt信號通路的機制,對于我們理解母源Wnt信號通路和探索背部決定因子的本質(zhì)有極大的指導意義。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：Q344
【圖文】：

別是辦／Ｕｖ／－２和辦／－３；在果蠅中有一個辦／２：在線蟲里有３個，分別是辦心７、逡逑辦／？－２、ｍ／ｇ＾Ｄｉｌｌｍａｎ邋ｅｔ邋ａ丨．，２０１３）。Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ在斑馬魚中共有５個基因，分別逡逑是辦＂ａ／／６／２／Ｊａ／５ｈ各個基因之間十分保守（圖１－１邋Ｂ）。逡逑Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ有３個保守的結構域，從Ｎ端到Ｃ端分別是ＤＩＸ、ＰＤＺ、ＤＥＰ逡逑（ＮＣＢＩ上還可以查到Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ結構域，但是其功能目前還沒有報導）（圖１－１逡逑Ａ）。Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ通過這３個結構域大約可同８０個蛋白質(zhì)相互作用。ＤＩＸ和ＰＤＺ逡逑結構域參與經(jīng)典Ｗｎｔ／（３－ｃａｔｅｎｉｎ信號通路，而ＰＤＺ和ＥＤＰ參與非經(jīng)典Ｗｎｔ／ＰＣＰ逡逑信號通路。每兩個相鄰結構域之間也有一些保守的序列，ＤＥＰ結構域下游有一逡逑個非常保守的Ｃ末端

Ｄｖｌ如何區(qū)分這兩個信號通路還不是很清楚。逡逑２．邋ＷｉｌＨ言號通路在斑馬魚早期胚胎發(fā)育中的作用逡逑斑馬魚早期胚胎發(fā)育一般指從一細胞期到原腸運動結束（圖１－３）。斑馬魚卵逡逑細胞受精后約４５ｍｉｎ，卵裂期開始，持續(xù)１０次有規(guī)律的分裂，這時合子的基因逡逑組還不能轉錄，胚胎發(fā)育完全由母源提供的ｍＲＮＡ或蛋白質(zhì)支撐和調(diào)節(jié)。約３ｈ逡逑后，胚胎進入囊胚期。在囊胚期，中期囊胚轉換（ｍｉｄ－ｂｌａｓｔｕｌａｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ，ＭＢＴ）逡逑開始，這時合子的染色體開始轉錄，合子產(chǎn)生的轉錄產(chǎn)物逐漸取代母源產(chǎn)物接管逡逑胚胎發(fā)育的調(diào)節(jié)（Ｋｉｍｍｅｌ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋１９９５）。最早轉錄的合子基因，比如６ｏ：：ｏｒｃｉＡ－、ｃ７７0ｒｃ／／７？、逡逑ｇｏｏ＾ｅｃｏ／ｔ／、ｖｏｘ／ｖｅ／７ｆ／ｖｅ＜ｉ、和辦是背腹決定的調(diào)節(jié)因子。其中一■些基因逡逑如ｔｏｚｏｚｏＡ－決定了胚盾的形成（Ｌｅｕｎｇ邋ｅｔ邋ａｌ．，２００３）。囊胚期卵黃合胞體層開始形成，逡逑３逡逑

邐？Ｇｅｎｅ邋ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ逡逑Ｃｋ邋）逡逑圖１－２，圖示Ｗｉｌｔ信號通路各組分及其轉導過程（Ｈａｂａｓ邋ａｎｄ邋ｌ）ａｗｉｄ，２００５）。逡逑（ａ）細胞質(zhì)中的（３－ｃａｔｅｎｉｎ在經(jīng)典Ｗｎｔ信號通路沒有被激活的情況下會被一個（３－ｃａｔｅｎｉｎ降逡逑解復合體磷酸化并降解。當Ｗｎｔ配體同Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受體和輔受體ＬＲＰ５／６結合后，經(jīng)典Ｗｎｔ逡逑信號通路被激活。Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ的ＤＩＸ和ＰＤＺ結構域結合一些因子如ＧＳＫ３和ＣＫ１，形成一逡逑個復合體，抑制了邋ｐ－ｃａｔｅｎｉｎ的降解。ｐ－ｃａｔｅｎｉｎ在細胞質(zhì)中聚集并入核，同ＴＣＦ／ＬＥＦ家族因逡逑子結合，激活靶基因的表達。（ｂ）對于非經(jīng)典Ｗｎｔ信號通路，Ｗｎｔ配體同Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受體的結逡逑合不需要ＬＲＰ５／６，利用Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ的ＰＤＺ和ＤＥＰ結構域，這一通路激活了一些�。牵裕校幔螅邋义虾停遥幔�，引發(fā)了細胞骨架的變化。（ｃ）對于Ｗｎｔ－Ｃａ２＋信號通路，Ｗｎｔ配體同Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受體結逡逑合，激活了邋Ｇ蛋白。這一過程需要ＰＫＣ，邋ＣａｍＫ２和Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ的ＰＤＺ和ＤＥＰ結構域。逡逑綜上

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本文編號：2763086