【摘要】：第一部分基于二代測(cè)序的中國人群急性髓系白血病基因突變模式及生物信息學(xué)分析研究背景急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是起源于髓系造血祖細(xì)胞的異質(zhì)性惡性克隆性疾病,以骨髓和外周血中髓系原始細(xì)胞大量克隆增殖、抑制正常骨髓造血為特點(diǎn)。時(shí)至今日,化療仍是治療該病的主要手段,幾十年來尚未取得重大突破。但是不同患者的臨床病程和預(yù)后不同,對(duì)化療的反應(yīng)也不同。已有許多研究揭示了分子異常在AML中的作用和影響,并提出了精準(zhǔn)醫(yī)療和個(gè)體化醫(yī)療的概念。目前,一些AML中常見的基因異常如FLT3內(nèi)部串聯(lián)重復(fù)(FLT3-ITD)已被加入危險(xiǎn)度分層和預(yù)后判斷的評(píng)價(jià)體系。在二代測(cè)序技術(shù)大規(guī)模應(yīng)用的時(shí)代,研究基因突變及其在疾病中所起的作用對(duì)發(fā)展精準(zhǔn)醫(yī)療和個(gè)體化醫(yī)療具有重要臨床意義。目前已有多篇報(bào)道揭示了 AML患者中的重現(xiàn)性基因突變異常,一些被證明提示預(yù)后良好,一些被證明提示預(yù)后不良。然而更多關(guān)于體細(xì)胞突變與臨床特征之間的關(guān)系及內(nèi)在機(jī)制仍待深入研究。此外,中國人群AML患者的基因突變模式鮮見報(bào)道。研究目的為了向AML診斷和治療提供更多信息和證據(jù),對(duì)78例中國人群AML患者進(jìn)行NCCN指南推薦的22個(gè)AML/MDS相關(guān)基因的靶向二代測(cè)序,旨在揭示基因型-表型演化關(guān)系,為精準(zhǔn)醫(yī)療和個(gè)性化治療提供理論依據(jù)和新藥開發(fā)方向。研究方法1.患者標(biāo)本78例于2016年2月至2017年10月期間在山東大學(xué)齊魯醫(yī)院接受治療并做了二代測(cè)序基因突變檢測(cè)的初診和隨訪AML患者被納入研究。根據(jù)法-美-英(FAB)分型,患者被劃分為M1、M2、M3、M4、M5、M6和未分類。所有患者均已簽署知情同意書。2.標(biāo)本處理收集78例AML患者的骨髓標(biāo)本,經(jīng)過紅細(xì)胞裂解液處理獲得單個(gè)核細(xì)胞,使用天根基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA。3.二代測(cè)序靶向22個(gè)基因的二代測(cè)序委托上海源奇公司借助Illumina公司HiSeq系統(tǒng)實(shí)施,平均測(cè)序深度2000×。文庫由至少10μg基因組DNA構(gòu)建。后續(xù)的序列拼接比對(duì)參考人類參考基因組GRCh37。該22個(gè)基因來自2015年NCCN指南推薦的MDS和AML相關(guān)基因突變。4.Sanger 測(cè)序通過二代測(cè)序發(fā)現(xiàn)的一些未報(bào)道的體細(xì)胞突變委托鉑尚生物技術(shù)公司進(jìn)行Sanger測(cè)序檢驗(yàn)。針對(duì)突變區(qū)域設(shè)計(jì)特異性測(cè)序引物,然后進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。對(duì)PCR產(chǎn)物的一代測(cè)序由ABI PRISM 3730x1遺傳分析儀器完成。后續(xù)基因序列可視化過程在SnapGene Viewer 3.2軟件中進(jìn)行。5.數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析借助SPSS24.0軟件完成。非正態(tài)分布的連續(xù)型變量由中位數(shù)(四分位數(shù)間距)表示。兩組呈正態(tài)分布的的連續(xù)型變量的均值由獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較。非正態(tài)變量由非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行比較。對(duì)四格表資料由卡方檢驗(yàn)或Fisher確切概率檢驗(yàn)進(jìn)行比較。單因素和多因素分析由線性回歸和邏輯回歸完成。生存分析做Kaplan-Meier分析和Cox回歸分析。p值小于0.05認(rèn)為有意義。6.生物信息學(xué)分析借助 mutationtaster、PolyPhen2、mutationassessor 和 SIFT 軟件預(yù)測(cè)新發(fā)現(xiàn)的PHF6 H302R點(diǎn)突變對(duì)蛋白和疾病的影響。利用cBioportal在線軟件制作基因突變模式圖。利用cBioportal和UALCAN在線軟件對(duì)TCGA公開的AML數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算和圖形繪制�；蛲蛔兒退幬锩舾行灾g的關(guān)系通過檢索查詢GDSC數(shù)據(jù)庫進(jìn)行預(yù)測(cè)。研究結(jié)果1.中國人群AML患者基因突變譜特征78例AML患者平均年齡53歲,男性占56%,其中62例(80%)患者至少存在一個(gè)基因突變,突變頻數(shù)為1-6。FLT3突變頻率為26%,NRAS 17%,NPM115%,DNMT3A 和 IDH214%,ASXL112%,KIT、IDH1、TET2 和 U2AF19%,CEBPA 和 SRSF2 6%,EZH2 和 SF3B1 4%,TP53、SETBP1 和 ETV6 3%,RUNX1、PHF6、CBL和JAK2 1%。ZRSR2編碼區(qū)未發(fā)現(xiàn)突變。檢測(cè)到的突變包括點(diǎn)突變、插入/缺失突變,多數(shù)突變傾向發(fā)生于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)重要結(jié)構(gòu)域中。2.基因突變與臨床和實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)之間的關(guān)系以60歲為分界線將患者劃分為老年患者(60歲)和中青年患者(60歲),Fisher確切概率檢驗(yàn)提示SRSF2突變與老年相關(guān)。在單因素分析中,伴有FLT3突變的患者顯示出更高的骨髓原始細(xì)胞數(shù)、外周血原始細(xì)胞數(shù)、流式異常細(xì)胞比例和白細(xì)胞數(shù)。伴有TET2突變的患者顯示出更高的外周血原始細(xì)胞數(shù)。在外周血原始細(xì)胞數(shù)和白細(xì)胞數(shù)的多因素分析中,FLT3和TET2都是危險(xiǎn)因素。另外,TET2突變與首次化療后未緩解(NR)相關(guān)。盡管伴有SRSF2突變的患者首次化療后均為NR,但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。3.基因突變對(duì)臨床預(yù)后的影響伴有三種或以上突變的患者總生存期較伴有少于三種突變的患者短。伴有表觀調(diào)節(jié)基因(DNMT3A、TET2、ASXL1、IDH1/2、EZH2)突變的患者比不伴有這些突變的患者生存期短。伴有IDH1/2突變的患者比不伴有這些突變的患者生存期短。對(duì)全部AML人群,多因素分析顯示FLT3-ITD、DNMT3A、IDH1、TET2和SRSF2突變是危險(xiǎn)因素。對(duì)非M3患者,多因素分析顯示FLT3-ITD、DNMT3A、IDH1和SRSF2突變是危險(xiǎn)因素。對(duì)老年AML患者,多因素分析顯示FLT3-ITD、DNMT3A和IDH1突變是危險(xiǎn)因素。對(duì)細(xì)胞遺傳學(xué)正常的AML患者,多因素分析顯示FLT3-ITD、DNMT3A和IDH突變是危險(xiǎn)因素。4.一代測(cè)序驗(yàn)證的新發(fā)現(xiàn)突變通過二代測(cè)序發(fā)現(xiàn)了 cosmic數(shù)據(jù)庫和文獻(xiàn)中未報(bào)道過的15種新突變,包括1種點(diǎn)突變PHF6H302R和14種插入/缺失突變。對(duì)其中6例插入/缺失突變標(biāo)本進(jìn)行Sanger測(cè)序驗(yàn)證,有5例檢測(cè)到移碼,有1例可能由于等位基因變異頻率低(5.47%),低于Sanger測(cè)序檢測(cè)閾值,因此未檢測(cè)到移碼。使用mutationtaster、PolyPhen2、mutationassessor和SIFT軟件預(yù)測(cè)PHF6H302R點(diǎn)突變對(duì)蛋白和疾病的影響,結(jié)果均為致病/損害大/影響大/影響蛋白功能。5.中國人群AML和白種人突變模式的比較通過計(jì)算分析TCGA公開的白種人AML基因突變數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)基因突變譜與中國人群AML相似,但NRAS、ASXL1、SRSF2突變率較中國人群低,NPM1、DNMT3A、RUNX1突變率較中國人群高。6.基因突變與藥物敏感性的關(guān)系通過檢索GDSC數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)伴有個(gè)別基因突變的AML細(xì)胞系對(duì)一些藥物或小分子化合物具有更高或更低的敏感性。結(jié)論1.80%患者至少存在一個(gè)基因突變,而其中近半數(shù)為只含一個(gè)突變。2.FLT3突變與TET2突變與外周血原始細(xì)胞數(shù)和白細(xì)胞數(shù)相關(guān)。3.TET2突變與第一周期化療效果相關(guān)。4.FLT3-ITD、DNMT3A、IDH1、TET2和SRSF2突變是總生存期的危險(xiǎn)因素。5.發(fā)現(xiàn)了 15個(gè)新突變類型。6.總結(jié)了白種人AML突變特征,并與中國人群AML突變特征進(jìn)行了比較。7.總結(jié)了基因突變與藥物敏感性之間的關(guān)系。第二部分Irf8在急性T淋巴細(xì)胞白血病中的作用和機(jī)制研究研究背景急性T淋巴細(xì)胞白血病(T-ALL)是由基因突變引起的T系前體細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化導(dǎo)致的造血系統(tǒng)惡性克隆性疾病。近年來,隨著T-ALL治療的進(jìn)展,多數(shù)患者可獲得完全緩解,但復(fù)發(fā)率仍然很高,長(zhǎng)期生存率僅25-50%。因此,深入研究T-ALL的發(fā)病機(jī)制,尋找新的靶向治療策略,不僅具有重要的科學(xué)意義,更具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。很多研究表明,Notch1突變是公認(rèn)的T-ALL致病突變之一。Notch1是進(jìn)化保守的內(nèi)皮生長(zhǎng)因子樣跨膜受體蛋白(Notch)家族成員,其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與細(xì)胞增殖、分化和凋亡密切相關(guān)。2004年有文獻(xiàn)首次報(bào)道,超過50%的兒童及成人T-ALL患者存在Notch1激活突變現(xiàn)象,此后Notch1逐漸成為公認(rèn)的T-ALL致癌基因。在淋巴細(xì)胞形成過程中,Notch1可促進(jìn)T細(xì)胞的分化而抑制B細(xì)胞的分化,在T細(xì)胞形成與發(fā)展的多個(gè)階段發(fā)揮作用。研究表明,選擇性失活的Notch1信號(hào)通路可使T細(xì)胞增殖分化停滯,而Notch1基因突變可導(dǎo)致下游信號(hào)的持續(xù)激活,繼而促進(jìn)T-ALL的發(fā)生。關(guān)于白血病發(fā)生機(jī)制的“二次打擊”學(xué)說認(rèn)為,僅Notch1激活突變不足以導(dǎo)致白血病,仍需其他分子協(xié)同作用,共同導(dǎo)致T-ALL發(fā)生。干擾素調(diào)節(jié)因子8(Irf8)是干擾素調(diào)節(jié)因子家族中的一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子,在調(diào)節(jié)造血系統(tǒng)譜系分化方面起重要作用。研究表明,Irf8促進(jìn)粒系和B系細(xì)胞分化,而抑制單核-巨噬系和T系細(xì)胞分化。有報(bào)道顯示,Irf8在髓系白血病中表達(dá)降低;在急性髓系白血病(AML)中發(fā)生剪接突變,野生型和突變型Irf8轉(zhuǎn)錄本表達(dá)增加與無復(fù)發(fā)生存率降低相關(guān)。還有報(bào)道顯示Irf8在B系淋巴瘤不同亞型中存在表達(dá)差異,可作為一種新的診斷標(biāo)志物。此外,多項(xiàng)研究顯示,Irf8在鼻咽癌、食管癌、胃癌、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、腎癌等多種癌癥或其他疾病中發(fā)現(xiàn)甲基化水平改變,證明其本身是抑癌基因,由于異常甲基化導(dǎo)致其表達(dá)水平下調(diào),起到致癌作用。另有報(bào)道,在調(diào)節(jié)性樹突細(xì)胞中,Notch-RBP-J信號(hào)通路可通過MLL和PRC2等分子介導(dǎo)的組蛋白甲基化修飾使Irf8處于染色質(zhì)折疊狀態(tài),抑制其表達(dá)水平。而在巨噬細(xì)胞中,RBP-J可促進(jìn)Irf8蛋白合成。研究Irf8在T-ALL中的甲基化和基因表達(dá)水平及分子功能,有助于揭示Irf8和Notch1在T-ALL發(fā)生發(fā)展中的相互作用和機(jī)制,為T-ALL的診治提供新思路。本研究發(fā)現(xiàn),Ir8敲除小鼠的骨髓單個(gè)核細(xì)胞高表達(dá)Yes相關(guān)蛋白(YAP)分子。YAP是Hippo通路的重要成員,該通路參與器官發(fā)育、組織穩(wěn)態(tài)和再生等重要生理過程。最近的研究表明,YAP作為一種癌蛋白,對(duì)大多數(shù)實(shí)體瘤的發(fā)生或生長(zhǎng)至關(guān)重要,它的激活誘導(dǎo)癌癥干細(xì)胞的特性維持、增殖、化療耐藥性和轉(zhuǎn)移。而在白血病中,有報(bào)道顯示,YAP在慢性髓性白血病(CML)細(xì)胞中過表達(dá),抑制YAP的功能能夠抑制CML細(xì)胞增殖,促進(jìn)其凋亡。此外,YAP抑制劑維替泊芬可在體外增強(qiáng)伊馬替尼的功效并抑制體內(nèi)白血病的發(fā)生。但YAP在T-ALL中的表達(dá)水平和功能鮮見報(bào)道。由此提出科學(xué)假設(shè):在共同淋系祖細(xì)胞水平由于Irf8異常甲基化導(dǎo)致其mRNA表達(dá)水平下調(diào),進(jìn)而抑制B系分化,促進(jìn)T系細(xì)胞產(chǎn)生,協(xié)同Notch1使CLP轉(zhuǎn)化為白血病起始細(xì)胞,并通過下游分子YAP促進(jìn)白血病細(xì)胞干性維持或促進(jìn)耐藥,加速T-ALL發(fā)生和發(fā)展。研究目的研究Irf8協(xié)同Notch1激活促進(jìn)T-ALL發(fā)生發(fā)展的作用及分子機(jī)制。研究方法1.生物信息學(xué)分析檢索并計(jì)算分析oncomine數(shù)據(jù)庫公開的T-ALL芯片數(shù)據(jù),比較T-ALL患者與健康對(duì)照Irf8基因表達(dá)水平差異。利用MethPrimer在線網(wǎng)站分析Irf8啟動(dòng)子區(qū)域,預(yù)測(cè)CpG島密集程度。2.細(xì)胞培養(yǎng)293T細(xì)胞系使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)。病毒包裝前一晚將狀態(tài)良好的293T細(xì)胞按8×106-1×107/皿鋪種直徑10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿。小鼠lin-細(xì)胞使用含15%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基培養(yǎng)。CCRF-CEM細(xì)胞使用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)。293T細(xì)胞使用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)。3.MSCV-Notch1-IRES-GFP 病毒包裝擴(kuò)增 MSCV-Notch1-IRES-GFP、pKat、VSVG 菌液,提取三種質(zhì)粒,按照 7:5:3比例轉(zhuǎn)染已鋪皿的293T細(xì)胞,8h后換新鮮培養(yǎng)基,轉(zhuǎn)染48h和72h分別收集培養(yǎng)基上清,經(jīng)0.45μm濾器過濾,即為含MSCV-Notch1-IRES-GFP病毒顆粒的病毒液。4.體內(nèi)驗(yàn)證敲除Irf8協(xié)同Notch1激活促進(jìn)T-ALL發(fā)生發(fā)展常規(guī)飼養(yǎng)Irf8-/-和WT小鼠。提取Irf8-/-和WT小鼠骨髓細(xì)胞,lineage磁珠分選骨髓造血干/祖細(xì)胞(lin-細(xì)胞),加TPO、FLT3、SCF細(xì)胞因子過夜預(yù)刺激后加入MSCV-Notch1-IRES-GFP逆轉(zhuǎn)錄病毒液培養(yǎng),8h后更換新鮮培養(yǎng)基,48h后熒光顯微鏡下觀察熒光,流式檢測(cè)GFP細(xì)胞比例,尾靜脈注射經(jīng)致死劑量照射的C57BL/6J小鼠,8周后小鼠逐漸發(fā)病。檢測(cè)發(fā)病小鼠白血病相關(guān)指標(biāo),繪制生存曲線,驗(yàn)證敲除Irf8協(xié)同Notch1激活促進(jìn)T-ALL發(fā)生發(fā)展。5.構(gòu)建MSCV-Irf8-IRES-GFP逆轉(zhuǎn)錄病毒真核表達(dá)載體及病毒包裝設(shè)計(jì)含有酶切位點(diǎn)的Irf8 CDS區(qū)特異性克隆引物,從含有Irf8 CDS區(qū)的普通質(zhì)粒中克隆Irf8CDS區(qū),插入MSCV-IRES-GFP載體,構(gòu)建MSCV-Ir8-IRES-GFP真核表達(dá)載體。病毒包裝過程同MSCV-Notch1-IRES-GFP。6.構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)Irf8的T-ALL細(xì)胞株MSCV-Irf8-IRES-GFP病毒液感染CCRF-CEM細(xì)胞,擴(kuò)增,流式分選GFP陽性的細(xì)胞,即為穩(wěn)定表達(dá)Irf8的CCRF-CEM細(xì)胞株。7.細(xì)胞增殖、周期及藥物誘導(dǎo)的凋亡檢測(cè)調(diào)整細(xì)胞密度種96孔板,CCK8法檢測(cè)CCRF-CEM-GFP和CCRF-CEM-Ir8增殖速率差異。PI單染法檢測(cè)細(xì)胞周期差異。AnnexinV-APC/7-AAD雙染法檢測(cè)藥物誘導(dǎo)的凋亡率差異。8.YAP表達(dá)量檢測(cè)收集Irf8-/-和WT小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞、CCRF-CEM-GFP和CCRF-CEM-Irf8細(xì)胞,提取總RNA和總蛋白,RT-PCR和western blot檢測(cè)YAP mRNA和蛋白表達(dá)水平差異。研究結(jié)果1.T-ALL患者Irf8表達(dá)情況通過檢索oncomine數(shù)據(jù)庫公開的T-ALL芯片數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)在4項(xiàng)不同的研究芯片中,與健康對(duì)照相比,Irf8均顯示低表達(dá)。2.敲除Irf8協(xié)同Notch1突變促進(jìn)T-ALL發(fā)生發(fā)展提取Irf8-8-和WT小鼠骨髓細(xì)胞,lineage磁珠分選骨髓造血干/祖細(xì)胞(lin-細(xì)胞),感染MSCV-Notch1-IRES-GFP逆轉(zhuǎn)錄病毒,尾靜脈注射經(jīng)致死劑量照射的C57BL/6J小鼠,8周后小鼠逐漸發(fā)病,檢測(cè)到Irf8-/--Notch1小鼠較WT-Notch1小鼠生存期縮短,骨髓涂片和脾臟免疫組化顯示白血病細(xì)胞處于更原始階段,而兩組小鼠在發(fā)病時(shí)的外觀、血常規(guī)、體重增長(zhǎng)率、脾臟大小無明顯差別。3.T-ALL細(xì)胞系中過表達(dá)Irf8阻滯細(xì)胞周期,促進(jìn)凋亡CCK8檢測(cè)顯示,過表達(dá)Irf8的CCRF-CEM細(xì)胞增殖減慢,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示,過表達(dá)Irf8的細(xì)胞周期阻滯,藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡增加,證明Irf8具有抑癌基因作用。4.Irf8負(fù)調(diào)控YAP通過檢索GEO數(shù)據(jù)庫公開的過表達(dá)或敲減Irf8芯片,篩選可能的下游靶基因。對(duì)Irf8-/-和WT小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行western blot檢測(cè),發(fā)現(xiàn)YAP在Irf8-/-小鼠中顯著高表達(dá)。而在CCRF-CEM-Irr8細(xì)胞中,PCR檢測(cè)到Y(jié)AP低表達(dá)。結(jié)論1.r8在T-ALL中表達(dá)水平降低。2.過表達(dá)Irf8的T-ALL細(xì)胞系增殖減慢,細(xì)胞周期阻滯,藥物誘導(dǎo)的凋亡增加。3.I f8缺失能夠協(xié)同Notch1激活突變加速T-ALL發(fā)生發(fā)展4.Irf8負(fù)調(diào)控癌蛋白YAP。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R733.71
【圖文】：

圖２：邋７８例ＡＭＬ患者基因突變模式，包括總體突變率和每位患者突變類型。逡逑每一列代表一名患者，全灰色表示無突變，黑色方塊表示截短突變，紅色方塊逡逑表示開放閱讀框內(nèi)不移碼突變，綠色方塊表示點(diǎn)突變。逡逑３４逡逑

圖３：邋２１個(gè)基因中突變發(fā)生的位置、類型和頻數(shù)。彩色色塊代表基因重要結(jié)構(gòu)逡逑域，短棒所在的位置即基因突變發(fā)生的位置，短棒長(zhǎng)短與左側(cè)標(biāo)尺對(duì)比代表發(fā)逡逑生頻數(shù)。從中可看出，多數(shù)突變傾向發(fā)生于重要結(jié)構(gòu)域。逡逑３５逡逑

圖.M甘.1胭婦自1閱陽目曲，

本文編號(hào)：2759680