發(fā)布時間：2020-07-12 13:54

【摘要】：miRNA對植物體細胞胚發(fā)生具有重要的調(diào)節(jié)作用。本課題組前期研究中,以中國原產(chǎn)細葉百合為材料,篩選并鑒定了體細胞胚發(fā)生過程中關鍵差異表達的lpu-miR171a和lpu-miR171b。本研究在前期工作基礎上,繼續(xù)探討了miR171參與調(diào)控百合離體再生的方式,克隆了MIR171a/b基因初級轉(zhuǎn)錄本全長及其上游5’端啟動子序列,通過啟動子-GUS報告系統(tǒng)分析了該啟動子的功能和miR171基因的表達模式,從轉(zhuǎn)錄水平探討了miR171調(diào)節(jié)百合體胚發(fā)生的機制。主要試驗結果如下:(1)以細葉百合無菌苗淲片為外植體,分別通過直接和間接途徑成功誘導發(fā)生了體細胞胚。體胚直接誘導最佳培養(yǎng)基為MS+4.0μmol·L~-11 PIC+0.01μmol·L~-11 ABA,胚性愈傷組織誘導最佳培養(yǎng)基為MS+4.0μmol·L~-11 PIC+25.0μmol·L~-11 SA,誘導率均達100%。兩種途徑體胚發(fā)生過程差異較大,直接發(fā)生途徑中鱗片誘導產(chǎn)生球形胚后經(jīng)歷較長時間的心形胚階段和短暫的魚雷形胚時期,然后進入子葉期;間接發(fā)生途徑中胚性愈傷組織分化形成球形胚后需經(jīng)歷較長的魚雷形胚時期后進入子葉期,幾乎觀察不到心形胚時期。體細胞胚發(fā)生途徑的胚性獲得階段,隨體胚誘導率升高,miR171a/b的表達量下降,而其靶基因SCL6-II/I的表達量顯著上升。在器官發(fā)生途徑中,不定芽原基形成階段miR171顯著上調(diào)表達。分析認為,在百合離體再生過程中,miR171通過調(diào)節(jié)其靶基因SCL6參與了胚性獲得過程。(2)MIR基因轉(zhuǎn)錄的最初產(chǎn)物初級轉(zhuǎn)錄本含有短的開放閱讀框,能夠通過編碼短肽,在轉(zhuǎn)錄水平提高其特異miRNA表達。本研究采用RACE技術,克隆了細葉百合體胚發(fā)生相關MIR171a和MIR171b的全長初級轉(zhuǎn)錄本,大小分別為593 bp和404 bp,miR171家族不同成員間初級轉(zhuǎn)錄本的保守性較低。莖環(huán)結構pre-miR171a和pre-miR171b到轉(zhuǎn)錄起始位點(TSS)的距離分別為69 bp和22 bp,到3’polyA的距離分別為326 bp和239 bp。從TSS至pre-miR171的序列內(nèi),分別包含3個和1個短的開放閱讀框。(3)使用FPNI-PCR的方法進行染色體步移,成功克隆MIR171a和MIR171b基因TSS 5’上游側翼序列1450 bp和952 bp。這兩序列中均含有TATA-Box、CAAT-Box等核心啟動元件,以及多個相同或相似的轉(zhuǎn)錄因子結合位點,分析認為MIR171a和MIR171b的5’上游側翼序列均有啟動下游基因表達的能力。這兩個miRNA具有獨立的轉(zhuǎn)錄單元,且家族基因不同成員間在轉(zhuǎn)錄水平具有相似的調(diào)節(jié)模式。大量順式作用元件集中分布于轉(zhuǎn)錄起始位點上游-1 kb范圍,主要包括葉肉組織、根、花藥和種子特異性表達元件,以及響應光照、非生物脅迫和細胞分裂素、脫落酸、茉莉酸、水楊酸、乙烯等多種植物激素的元件,表明MIR171的調(diào)控方式復雜,可能受多條信號通路的共同影響。此外,MIR171基因啟動子序列內(nèi)含有大量糖和淀粉代謝響應元件,表明MIR171參與了碳水化合物的代謝。(4)根據(jù)MIR171a全長啟動子序列和順式作用元件分析結果,克隆了五個不同長度的缺失啟動子片段。將MIR171a基因的全長和缺失啟動子片段連接GUS報告基因,構建植物表達載體,使用花序侵染法成功轉(zhuǎn)化野生型擬南芥。經(jīng)過逐代抗性篩選鑒定,獲得了T3代轉(zhuǎn)基因種子和植株。T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥植株組織化學染色結果表明,MIR171a基因的上游5’區(qū)域具有啟動活性,可驅(qū)動GUS基因在擬南芥的子葉、幼根中穩(wěn)定表達。高光脅迫下,初生真葉中也可檢測到GUS基因的表達。其核心啟動區(qū)域在TSS上游-232 bp范圍內(nèi),-650 bp到-823 bp范圍內(nèi)存在特異性增強子。MIR171a啟動子驅(qū)動GUS在擬南芥中的表達具有時空特異性,萌動時GUS表達量最高,隨著植株生長逐漸下降,出芽15天后,檢測不到GUS基因表達。根據(jù)MIR171a啟動子的功能和miR171a在百合體胚發(fā)生中的表達模式,推測miR171a可能參與了體胚發(fā)生過程中子葉原基的發(fā)生和分化。(5)MIR171a啟動子可以響應光照、非生物脅迫和激素信號。高光脅迫和光照變化會誘導GUS含量顯著增加,其光照的響應區(qū)域定位在-650 bp到-823 bp之間。miR171啟動子驅(qū)動GUS表達量在干旱和高鹽脅迫條件下明顯上調(diào),但響應低溫誘導的敏感程度較低。多種激素可以影響MIR171a啟動子活性,在ABA、SA和MeJA等抗逆相關激素的作用下,GUS表達量升高,而BA則促使其表達量降低。植物體細胞胚發(fā)生過程中,往往伴隨著大量的逆境響應,分析認為miR171a可能通過參與逆境響應調(diào)控細葉百合的體胚發(fā)生。
【學位授予單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S682.29
【圖文】：

沈陽農(nóng)業(yè)大學博士學位論文多個突起，這些突起會發(fā)育形成次生體胚。次生體胚會不斷分化，會導增加。在體胚形成和生長發(fā)育過程中，接種的鱗片內(nèi)部組織（非切割損、隆起，接種后 50 d，形成少量黃色、干燥、顆粒狀的胚性愈傷組織。在適當條件下，也可經(jīng)間接途徑發(fā)育形成體細胞胚。a cb

圖 2-2 不同濃度 ABA 對 miR171a/b 及其靶基因 SCL6 II/I 的影響Fig.2-2 Expression profiles of miR171 and SCL6 II/I influenced byABA如圖 2-2 所示，miR171 的表達量受培養(yǎng)基附加 ABA 的影響較大，且對 miR171a 和miR171b 的影響明顯不同。ABA 的濃度為 0 到 10 μmol·L-1范圍內(nèi)，miR171a 的表達呈現(xiàn)先升高再下降的趨勢。當 ABA 濃度為 0.01 μmol·L-1時，體胚發(fā)生率最高達 100%，miR171a 的表達量最低。隨著 ABA 濃度的提高，體胚發(fā)生率逐漸下降，而 miR171a 的表達量逐漸提高，但表達量都低于對照；miR171a 的靶基因 SCL6-II 的表達與其呈相反趨勢，當 ABA 濃度為 0.01 μmol·L-1時表達量最高，極顯著高于其它處理，然后隨 ABA濃度的提高逐漸降低。miR171b 的表達趨勢與 miR171a 相似，隨著 ABA 濃度的增加，體胚誘導率下降，miR171b 表達量呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，也都低于對照；miR171b 的靶基因 SCL6-I 的表達量變化與 SCL6-II 明顯不同，呈先升后降的趨勢，當 ABA 濃度為 1μmol·L-1時表達量最高，極顯著高于其它處理。此結果表明，百合兩個 miR171 家族成員的表達量和體胚發(fā)生能力呈負相關，與相對應的靶基因則無明顯的相關趨勢（兩個miR171 成員間與其靶基因相關趨勢完全相反），此結果與賈娜娜（2016）的報道相符。這可能與靶基因的表達除了受 miRNA 調(diào)控之外，還參與了其他的代謝途徑有關（Xue et

沈陽農(nóng)業(yè)大學博士學位論文常光照下培養(yǎng)，可經(jīng)歷球形胚、魚雷形胚、子葉形胚最終成苗，主要表現(xiàn)為體胚間生，體胚發(fā)生過程和 Zhang 等（2016）的報道一致。間接再生與直接再生相比，沒顯的心形胚階段，同時魚雷形胚階段明顯，具有誘導時間長、體胚誘導率高，畸形率偏高的特點。a b c

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