【摘要】：為建立一種新的外源蛋白安全評估方法,構建轉外源基因酵母是關鍵步驟。本研究以來源于轉基因作物的抗除草劑合成酶蛋白CP4-EPSPS為研究模板,首先通過基因優(yōu)化和化學合成獲得cp4-epsps基因,優(yōu)化后基因密碼子適用性指數(CAI)為0.85,GC含量為52%。目的基因克隆至畢赤酵母表達載體p PICZb,經鑒定篩選正確的重組載體p PICZb-EPSPS電擊轉化至畢赤酵母GS115,cp4-epsps基因通過同源重組方式整合至酵母基因組,PCR擴增酵母基因組篩選得到在正確位點發(fā)生同源重組的4株陽性菌株。隨后,各陽性菌株分別于28℃、250~300 r/min培養(yǎng),0.5%甲醇誘導4 d后,提取各組菌株總蛋白,采用SDS-PAGE和western blotting鑒定CP4-EPSPS表達的正確性。CP4-EPSPS單克隆抗體及載體標簽C-MYC單克隆抗體的western blotting結果一致顯示cp4-epsps基因在畢赤酵母GS115中成功獲得表達,大小約50 ku。本實驗成功構建了轉cp4-epsps基因的畢赤酵母基因工程菌,為下一步開展轉基因作物CP4-EPSPS成份的安全評價奠定基礎。
【圖文】：

加等體積2×SDS上樣緩沖液煮沸，待蛋白電泳。1.2.5CP4-EPSPS蛋白的westernblotting鑒定采用SDS-PAGE分離蛋白樣品，同時PVDF膜采用甲醇預處理3~5s，放至轉印液浸潤半小時。電泳結束后取出凝膠，通過電轉移將蛋白轉移至PVDF膜，低溫操作，100V恒壓60~120min，取出雜交膜，TBST漂洗5min三次，5%脫脂奶粉溶液室溫封閉1h，TBST洗膜三次，加入CP4-EPSPS單克隆抗體(1:500)4℃過夜，TBST洗膜三次，Rabbitanti-mouseIgG-HRP(1:5000)稀釋液37℃孵育1h，TBST洗膜，放至暗盒，顯影。2結果與分析2.1pPICZb-EPSPS重組載體構建圖1pPICZb-EPSPS重組載體構建流程圖Fig.1TheconstructionofpPICZb-EPSPSvector圖1為pPICZb-EPSPS重組載體構建流程圖。其中化學合成的cp4-epsps基因首先克隆在pUC57載體上。pPICZb載體大小為3328bp，載體上SfuI和XbaI位點為cp4-epsps基因的同源重組位點，HindIII和EcoRV位點為pPICZb-EPSPS重組載體的鑒定位點。2.2cp4-epsps基因的優(yōu)化及擴增為提高mRNA的穩(wěn)定性及蛋白表達效率[24,25]，須根據畢赤酵母細胞Pichiapastoris的偏好性進行cp4-epsps基因密碼子優(yōu)化，減小稀有密碼子的使用，提高最優(yōu)密碼子在基因序列中的比例，同時使基因的GC含量保持在30~70%之間，豐富的GC含量可大大提高該基因的表達水平[26]，低水平GC含量將限制基因轉錄[26,27]�；騼�(yōu)化結果見圖2和圖3，優(yōu)化序列見附件1。

現代食品科技ModernFoodScienceandTechnology2017,Vol.33,No.1158圖2密碼子適用性指數Fig.2CodonAdaptationIndexes(CAI)注：該圖為基因序列各密碼子的利用率分布圖。一般認為當CAI為1.0時，基因表達水平最為理想，CAI值越高，其表達水平越高。圖3不同利用率密碼子在基因中的百分含量Fig.3FrequencyofOptimalCodons(FOP)圖2為基因序列中各密碼子的利用率分布圖，由密碼子適用性指數（Codonadaptionindex，CAI）表征。通常認為，當CAI為1.0時，是菌株表達最理想狀態(tài)，其表達水平最高，當CAI>0.9時，表達水平理想。圖2結果所示，序列經優(yōu)化后，其CAI值由0.77增加至0.85，表明理論表達水平將得到提高。圖3為不同利用率密碼子的百分含量。由圖可知，原始序列中利用率在90~100%的密碼子所占比例約50%，序列經優(yōu)化后，所占比例大于55%，提高了利用率在90~100%的密碼子的含量，同時利用率在70~80%，60~70%和50~60%的密碼子的含量相應提高。序列經優(yōu)化后，大大降低了稀有密碼子的比例。研究表明[25]當最優(yōu)密碼子含量低于40%時，mRNA的平均半衰期為5.4min，當最優(yōu)密碼子含量高于70%時，mRNA的平均半衰期為17.8min，可見密碼子的優(yōu)化對穩(wěn)定mRNA有重要作用。經過優(yōu)化，序列中平均GC含量由最初49%提高至52%。KudlaG等[26]研究比較了同一基因GC豐富序列和GC貧乏序列在哺乳動物細胞中的表達情況，發(fā)現GC含量豐富的序列更易進行有效的轉錄或mRNA的加工處理，GC含量豐富的序列通過提高mRNA的穩(wěn)定性從而提高基因的表達水平。在基因優(yōu)化過程中同時還去除A/T或G/C重復序列，避免mRNA形成發(fā)夾結構或其它特殊結構，防止mRNA過早終止翻譯[28,29]。最后，基于GenbankKP212901.1cp4-epsps基因序列(1368bp)，GS115菌株偏好性和載體要?

現代食品科技ModernFoodScienceandTechnology2017,Vol.33,No.1158圖2密碼子適用性指數Fig.2CodonAdaptationIndexes(CAI)注：該圖為基因序列各密碼子的利用率分布圖。一般認為當CAI為1.0時，基因表達水平最為理想，CAI值越高，其表達水平越高。圖3不同利用率密碼子在基因中的百分含量Fig.3FrequencyofOptimalCodons(FOP)圖2為基因序列中各密碼子的利用率分布圖，由密碼子適用性指數（Codonadaptionindex，CAI）表征。通常認為，當CAI為1.0時，是菌株表達最理想狀態(tài)，其表達水平最高，當CAI>0.9時，表達水平理想。圖2結果所示，序列經優(yōu)化后，其CAI值由0.77增加至0.85，表明理論表達水平將得到提高。圖3為不同利用率密碼子的百分含量。由圖可知，原始序列中利用率在90~100%的密碼子所占比例約50%，序列經優(yōu)化后，所占比例大于55%，提高了利用率在90~100%的密碼子的含量，同時利用率在70~80%，60~70%和50~60%的密碼子的含量相應提高。序列經優(yōu)化后，大大降低了稀有密碼子的比例。研究表明[25]當最優(yōu)密碼子含量低于40%時，mRNA的平均半衰期為5.4min，當最優(yōu)密碼子含量高于70%時，mRNA的平均半衰期為17.8min，可見密碼子的優(yōu)化對穩(wěn)定mRNA有重要作用。經過優(yōu)化，序列中平均GC含量由最初49%提高至52%。KudlaG等[26]研究比較了同一基因GC豐富序列和GC貧乏序列在哺乳動物細胞中的表達情況，發(fā)現GC含量豐富的序列更易進行有效的轉錄或mRNA的加工處理，GC含量豐富的序列通過提高mRNA的穩(wěn)定性從而提高基因的表達水平。在基因優(yōu)化過程中同時還去除A/T或G/C重復序列，避免mRNA形成發(fā)夾結構或其它特殊結構，防止mRNA過早終止翻譯[28,29]。最后，基于GenbankKP212901.1cp4-epsps基因序列(1368bp)，GS115菌株偏好性和載體要?

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 林繼偉;張曉東;曹雪雁;胡鈞;;一種新的等溫單向生長基因合成法初步探索[J];遺傳;2007年06期

2 ;迄今最簡單有效的基因合成技術[J];生物醫(yī)學工程與臨床;2010年06期

3 王文凱;藍東明;王永華;楊博;;一種改進的基因合成方法[J];安徽農業(yè)科學;2011年18期

4 馮淼;王璐;田敬東;;基因合成技術研究進展[J];生物工程學報;2013年08期

5 長晟;;細菌酶制造基因[J];國外醫(yī)學情報;1983年09期

6 羅貴民;;來自細菌的酶能夠為人類制造基因[J];生命的化學(中國生物化學會通訊);1983年02期

7 柴勇;;可用于基因合成的新型酶[J];生物技術通報;1986年06期

8 石紹業(yè),潘時,劉虹,范慧奇,周靜;人類3個多肽基因的人工合成和對人工基因合成意義的探討[J];東北林業(yè)大學學報;1991年04期

9 陳常慶,戚志紅;基因合成[J];遺傳工程;1983年03期

10 干科達;陳常慶;;一種快速簡便的多肽基因合成方法[J];生物工程學報;1991年02期

相關會議論文 前2條

1 李玉;嚴紅;馬立新;;一種快速、簡便、經濟的基因合成方法[A];2006年度學術研討會論文摘要匯編[C];2006年

2 林建銀;徐劍文;林旭;齊元麟;張曉艷;;蛇毒金屬蛋白酶抑制劑的基因合成與蛋白表達[A];華東六省一市生物化學與分子生物學學會2006年學術交流會論文集[C];2006年

相關重要報紙文章 前2條

1 通訊員 陳勝偉　記者 葉輝;我成功克隆到將植物脂肪轉化為糖類的基因[N];光明日報;2010年

2 記者 劉霞;美“人造生命”小組發(fā)明簡單有效基因合成技術[N];科技日報;2010年

相關碩士學位論文 前3條

1 邱瑾;兩種木聚糖酶在畢赤酵母中的高效表達及最適pH的關鍵點研究[D];上海海洋大學;2016年

2 郭小霞;美達霉素生物合成相關基因的功能研究[D];華中師范大學;2015年

3 田聰慧;多基因共穩(wěn)定表達篩選載體與siat7e穩(wěn)轉MDCK細胞株的構建[D];聊城大學;2017年

本文編號：2746502