【摘要】：目的:(1)構建靶向動力相關蛋白1(dynamin-related protein 1,DRP1)基因的RNA干擾慢病毒表達載體,篩選穩(wěn)定表達shRNA-DRP1的胃癌細胞株。(2)探討DRP1基因沉默對胃癌細胞株BGC-823和MKN-45增殖、遷移、侵襲、凋亡及細胞周期的影響和機制。(3)檢測DRP1在胃腺癌組織中的表達,探討其與臨床病理特征和預后的關系。方法:(1)采用qPCR技術檢測正常人胃粘膜上皮細胞株GES-1、人胃癌細胞株MKN-28、SGC-7901、AGS、BGC-823及MKN-45中DRP1mRNA的表達水平,篩選出DRP1mRNA表達水平較高的細胞株用于基因干擾實驗。設計3對shRNA序列(KD1、KD2、KD3)并合成2條互補的、編碼shRNA的DNA單鏈,DNA單鏈退火形成雙鏈DNA(dsDNA),dsDNA與經(jīng)酶切的慢病毒載體連接。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5a,采用PCR法篩選陽性克隆并測序鑒定插入序列是否正確;將得到的重組質(zhì)粒在包裝輔助質(zhì)粒的輔助下共轉(zhuǎn)染293T細胞,倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白GFP的表達,評估轉(zhuǎn)染效率。以稀釋計數(shù)法測定病毒滴度。重組慢病毒載體感染MKN-45細胞并在熒光顯微鏡觀察評估轉(zhuǎn)染效率,采用qPCR技術檢測DRP1mRNA的表達,篩選出基因干擾效率最高的一對shRNA序列用于后續(xù)實驗。(2)以干擾效率最高的shRNA-DRP1慢病毒表達載體轉(zhuǎn)染BGC-823和MKN-45細胞株,同時設置NC組(細胞感染空病毒)和CON組(未感染的細胞),分別采用MTT實驗、克隆形成實驗、劃痕愈合實驗、Transwell侵襲實驗及流式細胞術檢測細胞增殖、遷移、侵襲、凋亡及細胞周期。為探討DRP1促進胃癌增殖的機制,采用western blot檢測細胞DRP1、Cleaved caspase-3、p-CDK1(Tyr15)、Cyclin B1及自噬標記物LC3的表達。為進一步探討DRP1在體內(nèi)對胃癌生長的影響,將攜帶shRNA-DRP1慢病毒載體的MKN-45細胞株接種于裸鼠皮下建立胃癌裸鼠皮下移植瘤模型,接種后第8 d、11 d、14 d、18 d、21 d測量種植瘤的體積,繪制生長曲線,21 d后處死裸鼠,獲取腫瘤,稱重。(3)采用免疫組化(IHC)技術檢測291例石蠟包埋的胃腺癌組織標本、145例近癌旁組織和遠癌旁組織標本中DRP1的表達情況,應用Kaplan-Meier法和多因素COX回歸風險模型分析DRP1表達與臨床病理特征和預后的關系。采用qPCR技術檢測10例新鮮胃腺癌近癌旁組織和遠癌旁組織標本中DRP1mRNA的表達水平。結果:(1)DRP1mRNA表達水平在MKN-45、BGC-823、AGS、SGC-7901、MKN-28、GES-1細胞中逐漸降低(P0.001);經(jīng)PCR篩選陽性克隆和測序結果顯示與GenBank中的人DRP1 cDNA序列一致,表示質(zhì)粒重組成功。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞后,倒置熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)大量綠色熒光,72 h達到高峰,提示慢病毒包裝成功。稀釋計數(shù)法檢測慢病毒滴度發(fā)現(xiàn),LV-shRNA-DRP1(KD1),LV-shRNA-DRP1(KD2)及LV-shRNA-DRP1(KD3)組的病毒滴度分別為1×10~9 TU/mL、4×10~9 TU/m L及8×10~8TU/m L。shRNA-DRP1慢病毒載體成功轉(zhuǎn)染MKN-45細胞,轉(zhuǎn)染效率達80%以上。qPCR檢測提示KD組的DRP1mRNA表達水平明顯降低,提示shRNA-DRP1對目的細胞的DRP1基因沉默有效,且LV-shRNA-DRP1KD3)組的敲減效率最佳(P0.01)。(2)MTT實驗結果顯示,轉(zhuǎn)染后連續(xù)培養(yǎng)4 d和5 d,KD組的OD490和OD490/fold均顯著低于NC和CON組(P0.001);克隆形成實驗結果示,KD組細胞克隆形成數(shù)較NC組顯著降低(P0.001),表明DRP1基因沉默能降低細胞的增殖能力。劃痕愈合實驗結果顯示,與NC組比較,KD組的劃痕愈合率顯著縮小(P0.01);Transwell侵襲實驗結果顯示,KD組的穿膜細胞數(shù)較NC組顯著降低(P0.01),提示DRP1基因沉默可抑制細胞遷移和侵襲的功能。流式細胞術檢測結果顯示,與NC組比較,KD組細胞凋亡率較顯著升高(P0.01),細胞周期分布呈現(xiàn)G2/M阻滯(P0.001),G1和S期細胞比例顯著減少(P0.001),提示DRP1基因沉默可引起細胞凋亡和G2/M期阻滯。Western blot檢測后發(fā)現(xiàn)DRP1基因沉默后,DRP1和Cyclin B1表達下調(diào)(均P0.001),Cleavedcaspase-3和p-CDK1(Tyr15)表達上調(diào)(均P0.001),LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低(P0.01),提示自噬受抑制。裸鼠皮下移植瘤實驗結果顯示,與NC組比較,KD組移植瘤體積明顯縮小,重量明顯減輕(均P0.001)。(3)免疫組化發(fā)現(xiàn)DRP1在胞漿呈棕黃色染色,DRP1在胃遠癌旁、近癌旁及腺癌組織中的表達陽性率逐漸升高(P0.001和P0.05);DRP1的表達陽性率隨著淋巴結轉(zhuǎn)移(P0.05)和TNM分期進展而升高(P0.05);Kaplan Meier生存分析發(fā)現(xiàn),DRP1陽性表達的患者的總體生存期(OS)較陰性表達者短(P0.01);多因素COX風險模型進行多因素分析發(fā)現(xiàn):年齡(P0.05)、分化程度(P0.05)、淋巴結轉(zhuǎn)移(P0.01)及DRP1陽性表達(P0.05)是影響胃腺癌預后的獨立危險因素。qPCR發(fā)現(xiàn),DRP1mRNA在胃遠癌旁、近癌旁及腺癌組織中的表達水平逐漸升高(P0.001)。結論:(1)DRP1基因沉默通過G2/M期阻滯、激活caspase-3及抑制線粒體自噬等途徑抑制BGC-823和MKN-45細胞增殖、遷移、侵襲及誘導凋亡等生物學功能。DRP1可能成為胃腺癌的潛在分子治療靶點。(2)DRP1在胃腺癌組織中過表達,DRP1的表達陽性率隨著淋巴結轉(zhuǎn)移和TNM分期進展而升高;DRP1陽性表達不但與患者總體生存率呈負相關,而且是胃腺癌患者預后獨立風險因素之一。
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R735.2
【圖文】：

A. BGC-823 細胞；B. MKN-45 細胞注：與 NC 和 CON 比較，***P<0.001圖 13. shRNA-DRP1 對 BGC-823 和 MKN-45 細胞增殖的影響（mean±SD）3 克隆形成實驗檢測細胞增殖shRNA 慢病毒感染 BGC-823 和 MKN-45 細胞，感染 3 d 后接種于 6 孔板，持續(xù)

A. BGC-823 細胞；B. MKN-45 細胞注：***P<0.001圖 14. shRNA-DRP1 對 BGC-823 和 MKN-45 細胞增殖的影響（mean±SD）4 劃痕愈合實驗檢測細胞遷移采用 image J 軟件測量各組的劃痕面積，計算劃痕愈合率=（0 h 的劃痕面積-48 h

【參考文獻】

相關期刊論文 前1條

1 Wanqing Chen;Rongshou Zheng;Hongmei Zeng;Siwei Zhang;Jie He;;Annual report on status of cancer in China, 2011[J];Chinese Journal of Cancer Research;2015年01期

本文編號：2742044