【摘要】：植原體是一類引起植物病害的重要原核致病菌,在植物韌皮部的篩管中專性寄生。植原體危害嚴(yán)重,在世界范圍內(nèi),受到植原體危害的植物有近千種,對經(jīng)濟作物、糧食作物以及觀賞型作物,均造成了巨大的損失。由于植原體傳播范圍廣,加強植原體的檢測與鑒定就成為了防治該病害的基礎(chǔ)。本實驗主要以植原體病原為研究對象,對幾種植原體病害進行調(diào)查與病原鑒定,并對棗瘋植原體imp基因克隆。主要實驗結(jié)果如下:1.通過對20株具有叢枝、黃化及葉片病變的植物進行調(diào)查和取樣,經(jīng)過16S rRNA基因的PCR擴增和測序鑒定,發(fā)現(xiàn)桑樹叢枝(mulberry witches'broom,MWB)、槐樹叢枝(Robinia pseudoacacia witches'broom,RpWB)、絲綿木叢枝(Euonymus bungeanus witches'broom,EbWB)、杏樹卷葉(apricot leafroll)、紅花槐叢枝(Robinia pseudoacacia cv.Honghuahuai witches'broom,RpWB-HHH和一品紅叢枝(poinsettia branch-inducing,PoiB)樣品均攜帶植原體,推斷為植原體病害。2.利用16S rRNA基因及轉(zhuǎn)運通道蛋白基因secY、延伸因子基因tuf和核糖體蛋白基因rp序列引物擴增桑樹叢枝病原,將其測序序列進行核苷酸同源性分析比對。結(jié)果發(fā)現(xiàn)桑樹叢枝與翠菊黃化組的16SrⅠ-B亞組典型成員的相似率為99.12%;與rpⅠ-B亞組、tufⅠ-B亞組和secYⅠ-B亞組桑樹萎縮的相似性分別達到99.59%、99.08%和99.48%。通過構(gòu)建系統(tǒng)進化樹和模擬RFLP分析發(fā)現(xiàn)桑樹叢枝屬于與16SrⅠ-B亞組、rpⅠ-B亞組、tufⅠ-B亞組和secYⅠ-B亞組的成員。3.使用16S rRNA、secY、rp、himA、tmkB和imp基因序列引物對棗瘋病、槐樹叢枝、絲綿木叢枝和紅花槐叢枝4個植原體病害樣品DNA進行PCR擴增,并進行測序和序列比對分析,構(gòu)建其系統(tǒng)進化樹。結(jié)果表明這4種植物的植原體16S rRNA基因序列都與16SrⅤ-B亞組處于同一分支;rp基因序列都與rpⅤ-C亞組成員接近;secY基因都與secYⅤ-C亞組接近;在himA和imp基因序列比對中,4種植原體都具有較高的相似率(大于95%),但是絲棉木叢枝植原體的tmkB基因序列與其他三株植原體相比,出現(xiàn)了較大差異,相似率均在74%左右。4.對棗瘋植原體免疫膜蛋白基因imp進行了PCR擴增和克隆,對Imp蛋白的跨膜區(qū)進行了預(yù)測,構(gòu)建了蛋白表達載體異源表達Imp蛋白,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Imp具有一個跨膜區(qū),完整的imp基因無法得到異源表達蛋白,去掉跨膜區(qū)后Imp蛋白得到表達。
【學(xué)位授予單位】：北京農(nóng)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S432.4
【圖文】：

圖 2-2 采集樣品的 16S rDNA 保守序列 PCR 擴增凝膠電泳圖注：M：markerr；ck：已知棗瘋植原體基因?qū)φ眨?～30：對應(yīng)表 2-1 樣品順序.3.3 基因比對分析將上述 PCR 產(chǎn)物送測序公司測序，所得序列用 BLAST 軟件進行序列比對分析，結(jié)果表明樹叢枝植原體的 16S rDNA 序列和 GenBank 中登錄的 MD（登錄號：KP662132）比對后發(fā)現(xiàn)苷酸同源序列相似率達到了 99.52%；槐樹叢枝植原體的 16S rDNA 序列和 RpWB（登錄號F848965）比對后核苷酸同源序列相似率為 99.93%；絲綿木叢枝植原體的 16S rDNA 序列與號為 KX669030 的 EbWB 進行核苷酸同源序列相似率比對，其相似率達到 99.93%；而對照病的16S rDNA序列與棗瘋JWB菌株（登錄號：AB442218）核苷酸同源序列相似率達到了100花槐叢枝的 16S rDNA 序列和 GenBank 中登錄的洋刺槐叢枝（登錄號：MF848965）比對后，核苷酸同源序列相似率為 98.76%；一品紅樣品與 PoiB（登錄號：HQ589205）進行核苷酸序列相似性比對，其相似率達到 97.91%（表 2-2）。表 2-2 16S rDNA 基因的核苷酸序列比對樣品 對比植原體病害 相似率/% 登錄號桑樹叢枝（MWB） 桑樹萎縮病（MD） 99.52% KP662132

農(nóng)學(xué)院碩士學(xué)位論文 第 3 章 桑樹叢枝（MWB）病原物的分eighbor-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。再將 4 種基因用 pDRAW32 軟件進行模擬 RELP 分析似系數(shù) F，相似系數(shù)計算公式：F=2×Nxy/(Nx+Ny) , F 代表相似系數(shù)，Nx和 Ny分別表示被個樣品（X 和 Y）的酶切條帶數(shù)，Nxy表示兩個樣品酶切后相同位置的 DNA 片段數(shù)[223 PCR 結(jié)果與序列比對分析.1 PCR 擴增結(jié)果以桑樹叢枝樣品總 DNA 為 PCR 擴增的模板，PCR 擴增桑叢枝病植原體 rp、tuf、secY 和A 基因，分別得到大小約為 1.2kb、0.8kb、1.4kb 和 1.4kb 的目的片段（圖 3-1）。

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本文編號：2732247