【摘要】：柑橘黃龍病(Huanglongbing,HLB)是世界性的柑橘檢疫性病害,其病原菌為韌皮桿菌屬(Liberibacter)的革蘭氏陰性細(xì)菌,其中亞洲種(‘Candidatus Liberibacter asiaticus’,CLas)是黃龍病的主要致病變種。植物應(yīng)對病原菌侵染防御機(jī)制中關(guān)鍵步驟是通過激活植物局部獲得性抗性(Local acquired resistance,LAR)進(jìn)一步引起系統(tǒng)獲得性抗性(Systemic acquired resistance,SAR),這一過程的核心激活信號為水楊酸(Salicylic acid,SA)。植株產(chǎn)生SAR需要SA信號分子的誘導(dǎo)和長距離信號分子水楊酸甲酯(Methyl salicylate,MeSA)的傳遞,水楊酸羧基甲基轉(zhuǎn)移酶(Salicylic acid carboxyl methyltransferase,SAMT)是SA和MeSA之間轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵紐帶,能催化SA甲基化為MeSA。有研究表明SA介導(dǎo)的抗性反應(yīng)在柑橘黃龍病抗性中起著重要作用,但其確切的作用機(jī)制未見報道。為了探討水楊酸信號途徑調(diào)控柑橘黃龍病抗性的相關(guān)機(jī)制,本研究以酸柚和錦橙為試材,從癥狀表現(xiàn)、病原菌生長、寄主解剖結(jié)構(gòu)變化、SA和MeSA水平等方面詳細(xì)研究了兩種柑桔抗性差異的可能原因,結(jié)果發(fā)現(xiàn)MeSA信號與品種抗性緊密相關(guān),在此基礎(chǔ)上,對產(chǎn)生MeSA信號的關(guān)鍵基因CsSAMT-1進(jìn)行了深入的研究。具體的研究結(jié)果如下:1、酸柚和錦橙對黃龍病耐性差異分析對酸柚和錦橙進(jìn)行黃龍病耐性評價發(fā)現(xiàn),酸柚感染黃龍病后發(fā)病所需時間較錦橙長,感病后癥狀較錦橙輕,顯癥所需菌量較錦橙多,感病后淀粉粒和胼胝質(zhì)積累量則少于錦橙,韌皮部加厚程度也明顯小于錦橙,結(jié)果表明酸柚較錦橙具有一定的黃龍病耐受性。2、酸柚和錦橙感病前后SA、MeSA水平差異利用HPLC-MS/MS法測定感病前后兩種物質(zhì)含量發(fā)現(xiàn),對照組中,酸柚葉脈SA和MeSA含量分別為9.02 ng·g~(-1)(FW)和12.33 ng·g~(-1)(FW),均顯著高于錦橙(1.86 ng·g~(-1)和0.04 ng·g~(-1),FW)。感染HLB后,錦橙中SA和MeSA含量均小幅升高,特別是葉脈中SA的含量增加了10.58倍(至19.69 ng·g~(-1),FW);相反,酸柚感染HLB后葉脈SA含量急劇下降(至3.74 ng·g~(-1),FW),MeSA含量則小幅升高(至16.02 ng·g~(-1),FW)。感病后錦橙中MeSA含量雖有一定程度上升(至0.51 ng·g~(-1),FW),但仍遠(yuǎn)少于酸柚中MeSA含量,且低于酸柚對照中MeSA水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:耐病酸柚對照中SA和MeSA含量均顯著高于易感錦橙,且HLB侵染后錦橙中MeSA的積累仍遠(yuǎn)低于酸柚。由此推測,酸柚對黃龍病有較高耐受性可能與其體內(nèi)大量的MeSA有關(guān)。3、酸柚和錦橙感病前后CsSAMT-1基因的表達(dá)差異定量PCR分析黃龍病侵染后CsSAMT-1基因的相對表達(dá)水平發(fā)現(xiàn),與對照植株相比,錦橙在HLB誘導(dǎo)下CsSAMT-1的表達(dá)水平明顯上升,且在葉脈中相對表達(dá)量顯著高于葉肉;酸柚在HLB誘導(dǎo)下CsSAMT-1表達(dá)水平上升趨勢則不明顯。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),感染HLB前,酸柚葉肉和葉脈中CsSAMT-1的表達(dá)量分別是錦橙的194.56倍和57.16倍;感染HLB后,下降為4.08倍和5.48倍,但仍高于錦橙。結(jié)果表明,CsSAMT-1在高感錦橙中受HLB誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá),在耐病酸柚中CsSAMT-1并不受HLB誘導(dǎo)顯著上調(diào),而是呈初始高水平表達(dá),在感病前其表達(dá)水平就已顯著高于錦橙。由此推測,CsSAMT-1基因的高表達(dá)在柑橘對抗黃龍病侵染中有著重要作用。4、外施SA和MeSA誘導(dǎo)酸柚及錦橙CsSAMT-1基因表達(dá)分析在SA、MeSA誘導(dǎo)下,錦橙和酸柚中CsSAMT-1基因的表達(dá)水平均上調(diào)。錦橙在SA、MeSA處理下CsSAMT-1表達(dá)水平均于12 h達(dá)到最高,酸柚均在處理6 h后達(dá)到最高,且6 h時酸柚中CsSAMT-1的表達(dá)量高于錦橙。結(jié)果表明酸柚響應(yīng)SA和MeSA誘導(dǎo)CsSAMT-1表達(dá)較錦橙早。5、CsSAMT-1基因的克隆和生物信息學(xué)分析分別用感染黃龍病的酸柚和錦橙對CsSAMT-1基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增,測序分析表明該基因的開放閱讀框?yàn)? 113 bp,編碼370個氨基酸,第42-370位氨基酸之間有一典型Methyltransf_7甲基轉(zhuǎn)移酶保守域,以SAM為甲基供體,作用底物之一為水楊酸。其一級結(jié)構(gòu)為親水性穩(wěn)定蛋白,進(jìn)化分析表明與可可、棉花的SAMT親緣關(guān)系較近。6、超量和干擾表達(dá)CsSAMT-1的轉(zhuǎn)基因錦橙表型分析以CaMV35S為啟動子,構(gòu)建了CsSAMT-1基因超量表達(dá)和RNAi干擾載體,并遺傳轉(zhuǎn)化錦橙上胚軸,經(jīng)GUS染色和PCR鑒定,共得到超表達(dá)CsSAMT-1的轉(zhuǎn)基因植株16株,RNAi干擾轉(zhuǎn)基因植株4株。與對照相比,在嫁接成活早期超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株的葉形較圓、葉色較綠、葉片較厚,而干擾表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株則表現(xiàn)為葉色較淺、葉片較厚,但隨著植株的生長這種葉色和葉形差異基本消失。對大部分轉(zhuǎn)基因植株葉片的長度和寬度測量分析,結(jié)果表明與對照植株無顯著差異,而幾乎全部轉(zhuǎn)基因植株的葉片顯著厚于對照植株。7、轉(zhuǎn)基因錦橙CsSAMT-1基因表達(dá)和SA、MeSA水平的分析超量表達(dá)CsSAMT-1的轉(zhuǎn)基因植株,基因表達(dá)水平較對照植株顯著上調(diào),SA和MeSA含量也較對照明顯升高,說明CsSAMT-1的超量表達(dá)促進(jìn)了SA向MeSA的正向轉(zhuǎn)化積累,并在非侵染部進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為SA發(fā)揮SAR,同時可能激發(fā)SA相關(guān)合成途徑補(bǔ)充大量的SA,使得植株整體保持較高的SA水平。干擾表達(dá)CsSAMT-1的轉(zhuǎn)基因錦橙,僅有兩個株系基因表達(dá)水平下調(diào),但四個株系的SA和MeSA含量均較對照植株明顯升高,具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。綜上所述,CsSAMT-1基因參與柑橘響應(yīng)黃龍病侵染的SA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,并通過促進(jìn)SA向MeSA的轉(zhuǎn)化以增強(qiáng)柑橘對黃龍病的耐性。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S436.66
【圖文】：

第 4 章 結(jié)果與分析第 4 章 結(jié)果與分析4.1 酸柚和錦橙黃龍病耐性差異分析4.1.1 接種黃龍病后所需發(fā)病時間差異于 2015 年 9 月同時對成熟度一致的錦橙和酸柚各接種黃龍病 20 株，三個月后（2015 年 12 月）提取葉脈 DNA 進(jìn)行 PCR 檢測植株感病情況。電泳結(jié)果顯示，接種的錦橙植株全部檢出 HLB 陽性，而酸柚植株則無一檢出（圖 4.1A、B）。后對酸柚植株每月檢測一次，直到 2016 年 9 月（接種 12 個月），有 10 株酸柚檢出感染了 HLB（圖 4.1 C），且在后續(xù)跟蹤檢測中無新增感病植株。試驗(yàn)結(jié)果表明，接種黃龍病后，酸柚較錦橙所需的發(fā)病時間長。

圖 4.2 酸柚和錦橙感染黃龍病后表型Fig 4.2 The phenotypic of Sour pomelo and Jincheng after infected HLB圖 4.3 顯癥葉片百分比Fig. 4.3 The percentage of symptomatic leaves in single plant注：* 表示酸柚和錦橙之間差異顯著（P ＜0.05）4.1.3 感病后顯癥所需菌量差異為了探究兩種柑橘感染黃龍病后的癥狀與其體內(nèi)病原菌含量的的關(guān)系，對感

【參考文獻(xiàn)】

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1 吳越;蘇華楠;黃愛軍;周彥;李中安;劉金香;周常勇;;柑橘黃龍病菌侵染對甜橙葉片糖代謝的影響[J];中國農(nóng)業(yè)科學(xué);2015年01期

2 王芳;殷幼平;孫麗琴;吳曉芳;王中康;;柑橘黃龍病罹病植株顯癥差異組織內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析[J];微生物學(xué)報;2014年08期

3 程春振;曾繼吾;鐘云;閆化學(xué);姜波;鐘廣炎;;柑橘黃龍病研究進(jìn)展[J];園藝學(xué)報;2013年09期

4 駱琰妍;李魏;戴良英;;不同激素信號途徑在植物抗病中的相互作用研究進(jìn)展[J];中國農(nóng)學(xué)通報;2013年18期

5 歐陽革成;方小端;郭明f ;;以礦物油乳劑為基礎(chǔ)的拒避—誘殺組合防治柑桔木虱試驗(yàn)初報[J];中國南方果樹;2010年05期

6 孟雪嬌;邸昆;丁國華;;水楊酸在植物體內(nèi)的生理作用研究進(jìn)展[J];中國農(nóng)學(xué)通報;2010年15期

7 王文天;彭少麟;李冬梅;王冬梅;王瑞龍;田彩娟;趙厚本;戶桂敏;;薇甘菊水楊酸羧甲基轉(zhuǎn)移酶基因的分離鑒定及表達(dá)分析[J];熱帶亞熱帶植物學(xué)報;2009年05期

8 范國成;劉波;吳如健;李韜;蔡子堅(jiān);柯沖;;中國柑橘黃龍病研究30年[J];福建農(nóng)業(yè)學(xué)報;2009年02期

9 尹玲莉;侯曉杰;;植物抗性信號分子——水楊酸研究進(jìn)展[J];中國農(nóng)學(xué)通報;2007年01期

10 劉繼紅,徐小勇,鄧秀新;柑橘體細(xì)胞雜種及其核質(zhì)遺傳研究進(jìn)展[J];農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報;2004年03期

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1 傅仕敏;柑橘黃龍病的細(xì)胞病理及其寄主轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究[D];西南大學(xué);2014年

2 黃愛軍;韌皮部桿菌亞洲種簡單重復(fù)序列（SSR）多態(tài)性及其侵染甜橙后轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究[D];西南大學(xué);2014年

3 馬健;楊樹（Populus spp.）與茶呰子葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）互作中SA和H_2O_2的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)特征[D];中國林業(yè)科學(xué)研究院;2012年

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2 劉登全;柑橘受黃龍病菌侵染后基因差異表達(dá)分析及抗病基因同源序列克隆[D];江西農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

3 金一鋒;外源性水楊酸誘導(dǎo)月季對黑斑病抗性的研究[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

4 徐日榮;水稻水楊酸甲酯合成酶基因OsBISAMT1的克隆鑒定和功能分析[D];浙江大學(xué);2004年

本文編號：2720715