發(fā)布時(shí)間：2020-06-10 15:30

【摘要】：研究背景:無毛基因(Hr)是Jumonji家族中的成員之一,定位于14號染色體上的D_2區(qū),在染色體上跨越14 kb,包含20個(gè)外顯子和18個(gè)內(nèi)含子,主要編碼1182個(gè)氨基酸,基因長度為19486 bp,其表達(dá)產(chǎn)物為約127 kDa的無毛蛋白(hairless protein,HR)。HR功能的缺失可引起毛囊解體,外根鞘細(xì)胞凋亡數(shù)目顯著增多,導(dǎo)致大部分外根鞘結(jié)構(gòu)被破壞,擾亂毛發(fā)的正常生長周期,使新毛發(fā)的形成受阻。目前對Hr基因的相關(guān)研究較少,我們不能斷定它的確切功能,但是Hr基因突變能夠?qū)е吕ッ餍∈竺l(fā)脫落并保持終身無毛狀態(tài),因此豫醫(yī)無毛小鼠可以作為我們研究毛發(fā)生長調(diào)控機(jī)制的模型。目的:探索Hr基因的基因功能。研究Hr基因突變對昆明小鼠皮膚中分子機(jī)制的影響,探究豫醫(yī)無毛小鼠表型發(fā)生變化的原因。研究方法:(1)構(gòu)建Hr基因過表達(dá)載體,將構(gòu)建成功的過表達(dá)載體通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方式轉(zhuǎn)染進(jìn)小鼠成纖維細(xì)胞(NIH3T3)中,利用Western Blot研究轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)HR蛋白的過表達(dá)效果,通過流式細(xì)胞術(shù)研究轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的增殖和凋亡情況,。(2)RNA干擾實(shí)驗(yàn):體外合成siRNA,將siRNA轉(zhuǎn)染進(jìn)小鼠成纖維細(xì)胞(NIH3T3),利用Western Blot研究轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)HR蛋白的表達(dá)效果,通過流式細(xì)胞術(shù)研究RNA干擾組細(xì)胞增殖和凋亡情況。(3)差異蛋白質(zhì)組學(xué):通過雙向電泳及生物質(zhì)譜技術(shù)篩選2月齡和6月齡野生昆明小鼠和豫醫(yī)無毛小鼠皮膚中差異表達(dá)的蛋白,并對這些差異蛋白進(jìn)行GO和KEGG分析,利用Western Blot對蛋白組學(xué)檢測結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果:(1)pEGFP-Hr-M和pEGFP-Hr-N重組載體構(gòu)建成功,經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染進(jìn)入小鼠成纖維細(xì)胞后,HR蛋白表達(dá)量顯著提高,但是對細(xì)胞的增殖和凋亡沒有顯著影響。(2)將四組特異的siRNA導(dǎo)入細(xì)胞后,HR蛋白表達(dá)量均降低,其中第二組siRNA靶點(diǎn)效果最好,但是對細(xì)胞的增殖和凋亡沒有顯著影響。(3)通過凝膠雙向電泳檢測得到的電泳圖譜,找到其中存在差異表達(dá)的蛋白點(diǎn)有850個(gè),選出其中差異較大的部分蛋白點(diǎn)做質(zhì)譜鑒定,鑒定成功的蛋白點(diǎn)有26個(gè)。(4)對鑒定出來的26個(gè)點(diǎn)進(jìn)行GO分析,對這些蛋白質(zhì)的生物學(xué)進(jìn)程進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)它們主要參與細(xì)胞進(jìn)程:15%;單一的生物過程:14%;應(yīng)激:12%;代謝過程:12%;細(xì)胞組分:9%;多細(xì)胞的生物過程:8%;發(fā)展過程:8%。從細(xì)胞組分來分析,有24%的差異蛋白被定位于細(xì)胞內(nèi),22%被定位于細(xì)胞器中,19%被定位于細(xì)胞外,11%被定位于大分子復(fù)合物中,其它還有少部分被定位于膜上、膜蛋白等處。根據(jù)分子功能分類,這些蛋白有50%具有結(jié)合作用,22%具有催化活性,10%具有結(jié)構(gòu)分子活性,剩下的部分分別具有分子功能調(diào)節(jié)作用、抗氧化活性、分子轉(zhuǎn)導(dǎo)活性和電子載體活性。(5)對這些差異點(diǎn)進(jìn)行KEGG分析,結(jié)果顯示差異基因主要分布在雌激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、抗原的處理與表達(dá)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白的加工和程序性壞死通路。(6)對其中的兩個(gè)與皮膚和毛發(fā)相關(guān)的差異蛋白:角蛋白17(KRT17)和Ⅲ型膠原蛋白(COL3A1)進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果與雙向電泳結(jié)果一致。豫醫(yī)無毛小鼠2月齡和6月齡皮膚中的KRT17表達(dá)量確實(shí)高于野生昆明小鼠2月齡和6月齡的皮膚。豫醫(yī)無毛小鼠2月齡的皮膚中COL3A1高于同時(shí)期的野生昆明小鼠,但是其6月齡小鼠皮膚中COL3A1低于同時(shí)期的野生昆明小鼠。結(jié)論:(1)Hr基因過表達(dá)和敲低均不會(huì)影響小鼠成纖維細(xì)胞(NIH3T3)的增殖和凋亡。(2)雙向電泳檢測出的差異蛋白有850個(gè),然后選取部分點(diǎn)經(jīng)過生物質(zhì)譜分析和生物信息學(xué)分析,找出了26個(gè)差異蛋白,這些差異蛋白主要集中在雌激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、抗原的處理與表達(dá)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白的加工和程序性壞死相關(guān)通路,Hr基因的突變影響了小鼠體內(nèi)的相關(guān)通路。(3)Hr基因突變上調(diào)了KRT17的表達(dá)量,KRT17表達(dá)量的增加導(dǎo)致了無毛小鼠的皮膚狀態(tài)發(fā)生變化。Hr基因的突變也影響了膠原蛋白的表達(dá),使得COL3A1在2月齡豫醫(yī)無毛小鼠皮膚中的表達(dá)量升高,但是其在6月齡豫醫(yī)無毛小鼠皮膚中的表達(dá)量降低,導(dǎo)致皮膚衰老等一系列變化。
【圖文】：

因在小鼠 14號染色體f hairless genes in mous無毛蛋白（ hairless位區(qū)（ nuclear matr localization signal，2）[8]。無毛蛋白的功有一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)，編化[9-11]。HR功能的大部分外根鞘結(jié)構(gòu)破]。通過病理學(xué)實(shí)驗(yàn)觀整的毛囊結(jié)構(gòu)，而是不能上移，毛發(fā)生長控毛發(fā)生長發(fā)育周

圖 1.1 無毛基因在小鼠 14號染色體的位置Figure 1.1 Location of hairless genes in mouse chromosome 14無毛基因的表達(dá)產(chǎn)物被稱為無毛蛋白（ hairless protein， HR），含有四個(gè)常重要的結(jié)構(gòu)域， 為核基質(zhì)定位區(qū)（ nuclear matrix targeting signal，TS）、核定位序列（ nuclear localization signal，， NLS）、富含半胱氨酸鋅結(jié)構(gòu)域和 JmjC結(jié)構(gòu)域（圖 1.2）[8]。無毛蛋白的功能目前仍然不是很清楚，是有數(shù)據(jù)顯示，無毛基因部位有一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)，編碼著高表達(dá)于腦部和皮膚的轉(zhuǎn)錄因子，表達(dá)呈周期性變化[9-11]。HR功能的缺失可引起毛囊解體，外細(xì)胞凋亡數(shù)目顯著增多，導(dǎo)致大部分外根鞘結(jié)構(gòu)破壞，毛發(fā)的生長周期不能常運(yùn)行，新的毛發(fā)形成受阻[5]。通過病理學(xué)實(shí)驗(yàn)觀察皮膚組織切片，研究者現(xiàn) Hr 基因突變小鼠已沒有完整的毛囊結(jié)構(gòu)，而是形成許多囊腫，以后也沒新的毛囊形成，真皮乳頭滯留不能上移，毛發(fā)生長信號中斷，毛發(fā)不能重新長[8]。可見，Hr 基因功能對調(diào)控毛發(fā)生長發(fā)育周期意義重大。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：Q78

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前5條

1 熊偉;;蛋白質(zhì)組雙向電泳技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用進(jìn)展[J];生命科學(xué)儀器;2010年01期

2 杜玉梅;左正宏;;基因功能研究方法的新進(jìn)展[J];生命科學(xué);2008年04期

3 郭春雨;殷惠軍;史大卓;;差異表達(dá)基因篩選技術(shù)及其在缺血性心臟病中的應(yīng)用[J];中國中西醫(yī)結(jié)合雜志;2007年06期

4 張學(xué)軍,周文明,趙建龍;生物芯片技術(shù)及應(yīng)用簡介[J];安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2003年01期

5 徐昊,王明榮,顏光濤;脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)進(jìn)展及其應(yīng)用[J];國外醫(yī)學(xué).預(yù)防.診斷.治療用生物制品分冊;2000年06期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 章金濤;豫醫(yī)無毛小鼠的生物學(xué)特征及其分子遺傳學(xué)研究[D];浙江大學(xué);2005年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 陳瑩瑩;Hr基因敲除小鼠的構(gòu)建及其生物學(xué)特性的初步研究[D];鄭州大學(xué);2017年

2 李陳;人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞源性的類許旺細(xì)胞與人胎兒坐骨神經(jīng)許旺細(xì)胞差異蛋白組學(xué)的研究[D];蚌埠醫(yī)學(xué)院;2014年

本文編號：2706489