【摘要】：磷脂是生命的基礎(chǔ)物質(zhì),是人類(lèi)及動(dòng)植物組織細(xì)胞膜的重要組成成分,是人體正常代謝與健康生存不可缺少的物質(zhì)同時(shí)磷脂酰膽堿也是植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要代謝物,也是植物細(xì)胞膜主要脂質(zhì)組分。大豆磷脂酰甲基轉(zhuǎn)移酶(GmPLMT)存在于大豆磷脂酰膽堿合成途徑中,是卵磷脂合成的關(guān)鍵酶。為了探明大豆中GmPLMT基因具體功能,為大豆種質(zhì)的改良提供備選基因,本研究從吉育72號(hào)大豆中克隆了得到了GmPLMT基因,構(gòu)建植物表達(dá)載體并進(jìn)行擬南芥和大豆的遺傳轉(zhuǎn)化,獲得轉(zhuǎn)基因植株后進(jìn)行基因表達(dá)量及生理生化指標(biāo)的測(cè)定,與非轉(zhuǎn)基因植株的基因表達(dá)量生理生化指標(biāo)共同分析。試驗(yàn)結(jié)果表明:(1)通過(guò)常規(guī)PCR方法,利用NCBI中序列設(shè)計(jì)特異性引物,成功從吉育72號(hào)大豆中成功克隆GmPLMT基因全長(zhǎng)cDNA序列,包括完整ORF序列504bp,與NCBI中的GmPLMT序列一致。(2)構(gòu)建了植物表達(dá)載體pCAMBIA3301-GmPLMT,并通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化擬南芥和大豆,采用草丁膦除草劑篩選法、PCR鑒定法、southern雜交法共同驗(yàn)證,證明成功獲得大量T3代擬南芥和1株T1代轉(zhuǎn)基因大豆,并證明GmPLMT基因以單拷貝形式整合入了大豆和擬南芥基因組中,其中在擬南芥基因組中整合位置不同。(3)利用熒光定量PCR法測(cè)定大豆不同生育時(shí)期中成熟期的根中的GmPLMT基因表達(dá)量最高為0.66是同時(shí)期葉片的7.4倍,說(shuō)明GmPLMT基因在成熟期大豆中主要表達(dá)于根部;在大豆種子成熟過(guò)程中,每隔5天取一次樣品,共采樣10次,種子中GmPLMT基因的變化呈先升高后降低的趨勢(shì),第一次樣品基因表達(dá)量為0.061之后逐漸降低至第四次樣品的0.004,也是整個(gè)大豆成熟過(guò)程中的最低值,之后逐漸升高,在第八次達(dá)到最大值0.25之后含量迅速降低至0.061,可知GmPLMT基因表達(dá)量在大豆種子逐漸成熟過(guò)程中呈動(dòng)態(tài)變化;測(cè)定大豆種子中磷脂類(lèi)(磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇)、脂肪酸的含量,并通過(guò)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)不同成熟度大豆種子中GmPLMT基因與磷脂酰膽堿含量呈顯著正相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.5,磷脂酰膽堿含量與亞油酸、亞麻酸均呈顯著正相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為0.74和0.82,可見(jiàn)GmPLMT基因的表達(dá)量提高能夠直接的增加大豆種子中磷脂酰膽堿和脂肪含量,間接提高大豆種子中多不飽和脂肪酸的含量。(4)利用熒光定量PCR法測(cè)定轉(zhuǎn)基因T3代擬南芥不同生育時(shí)期GmPLMT基因的表達(dá)量,開(kāi)花期GmPLMT基因表達(dá)量最高達(dá)到了0.139,成熟期最低為0.054,僅為開(kāi)花期的38.8%,可見(jiàn)轉(zhuǎn)基因T3代擬南芥中開(kāi)花期基因表達(dá)量最高。多種生化方法測(cè)定轉(zhuǎn)基因擬南芥種子中磷脂類(lèi)、脂肪酸的含量、粗脂肪含量,與野生型擬南芥種子對(duì)照中看出,轉(zhuǎn)基因擬南芥中總磷質(zhì),磷脂酰膽堿,磷脂酰乙醇胺含量大幅度提高分別為2.02倍、2.09倍、1.36倍;亞油酸,亞麻酸的含量均有提高,提高比例分別為4.51%和3.39%。與在大豆中相關(guān)性分析結(jié)果一致�？梢�(jiàn)通過(guò)轉(zhuǎn)基因提高GmPLMT基因的表達(dá)量不僅能夠大幅度提高磷脂酰膽堿及總磷質(zhì)含量同時(shí)能夠提高植物種子內(nèi)多不飽和脂肪酸的含量。
【圖文】：

Tab.2-8：Digestion of recombinant plasmidsMT 基因的克隆總 RNA 的提取提取到大豆葉片的總 RNA，并用 NANO DROP 2000 測(cè).02。用 1%的瓊脂糖變性膠電泳，三條帶清晰，證明總于后續(xù)反轉(zhuǎn)錄以及 RT-PCR 實(shí)驗(yàn)(見(jiàn)圖 2.1)。

GmPLMT重組質(zhì)粒驗(yàn)證M：DL2000DNAmarker；1：質(zhì)粒PCR；2：菌液PCR；3：質(zhì)粒雙酶切Fig.2.3GmPLMTrecombinantplasmidvalidationM：DL2000DNAmarker；1：RecombinantplasmidPCR；
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：Q943.2;S565.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2705355