【摘要】：在生殖過程中,卵黃原蛋白作為卵黃前體,是卵生生物包括昆蟲中非常重要的。卵黃原蛋白的轉(zhuǎn)錄通常是由激素調(diào)控的,比如保幼激素、蛻皮激素及某些神經(jīng)肽。關(guān)于昆蟲卵黃原蛋白的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究主要集中在雙翅目與鱗翅目,膜翅目昆蟲的卵黃原蛋白轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究較少。蘭州熊蜂作為一種重要的授粉昆蟲,擴(kuò)大其繁殖量,產(chǎn)生更多的工蜂后代可更好地滿足實(shí)際應(yīng)用中授粉的需求�；诖�,研究蘭州熊蜂的轉(zhuǎn)錄調(diào)控具有十分重要的意義。主要結(jié)果如下:1、蘭州熊蜂卵黃原蛋白基因結(jié)構(gòu)及表達(dá)特性蘭州熊蜂卵黃原蛋白基因(Genbank號(hào):MF632304)全長(zhǎng)為7227bp,包含7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子,其mRNA(Genbank號(hào):MF632303)序列長(zhǎng)度為5319bp,編碼的蛋白長(zhǎng)度為1772個(gè)氨基酸、分子量201.5 kDa及等電點(diǎn)為6.21。對(duì)蘭州熊蜂的卵黃原蛋白(BlVg)進(jìn)行保守域分析,發(fā)現(xiàn)其具有典型的卵黃原蛋白結(jié)構(gòu)域:第一,在N端附近的Vitellogenin_N保守域從第28個(gè)氨基酸開始,到第750個(gè)氨基酸終止;第二,中間部位有保守域DUF1943,自第783個(gè)氨基酸起至第1043氨基酸;第三,在C端第1450個(gè)氨基酸至第1620個(gè)氨基酸為保守域VWD。通過系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn),其與其他熊蜂物種位于一個(gè)分支上。分別取處女蜂王及產(chǎn)卵蜂王的頭、飛行肌、卵巢與脂肪體組織,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)BlVg的mRNA表達(dá)量。qRT-PCR結(jié)果顯示,相同生殖狀態(tài)下的蜂王,在脂肪體中表達(dá)量最高(處女王為383.9-倍;產(chǎn)卵蜂王為3357.07倍),飛行肌、頭次之,卵巢最低,且不同組織之間均存在顯著性差異(p0.05)。在相同組織中,產(chǎn)卵蜂王的BlVg的mRNA表達(dá)量顯著高于處女蜂王(p0.05)。2、蘭州熊蜂轉(zhuǎn)錄因子Broad-Complex基因的特征及真核表達(dá)蘭州熊蜂Broad-Complex基因選擇性剪切體眾多,通過PCR獲得Z1-Z4這四種剪切體,分別命名為BlBrC-Z1、2、BlBrC-Z3和BlBrC-Z4,它們的核苷酸長(zhǎng)度分別為1491 bp、1293 bp、1257 bp與1239 bp。蘭州熊蜂B1BrC蛋白具有典型的Broad-Complex蛋白應(yīng)有的保守域:第一,在N端附近的中心區(qū)域由BTB保守域及Linker組成;第二,在C端為各種選擇性剪切體特異的鋅指結(jié)構(gòu)域。通過與蘭州熊蜂基因組數(shù)據(jù)(未發(fā)表)比對(duì),發(fā)現(xiàn)這四種剪切體在DNA上的排列順序?yàn)閆4、Z3、Z2、Z1。通過熒光定量PCR發(fā)現(xiàn),與處女蜂王相比,產(chǎn)卵蜂王的卵巢中BlBrC-Z1與BlBrC-Z3表達(dá)量顯著升高。將這四種剪切體構(gòu)建至pBmFlag-B1BrC重組質(zhì)粒進(jìn)行真核表達(dá)。通過Western blot證明這四個(gè)蛋白均成功表達(dá)。3、蘭州熊蜂卵黃原蛋白基因BlVg啟動(dòng)子的活性分析采用染色體步移法,以蘭州熊蜂腹部DNA為模板,獲得卵黃原蛋白基因BlVg起始密碼子上游1517 bp長(zhǎng)度的5'側(cè)翼序列。生物信息學(xué)分析顯示,該序列具有TATAbox、CAATbox、C/EBP等基本元件和DBrC3、DE74等響應(yīng)蛻皮激素信號(hào)的重要結(jié)合元件。隨后構(gòu)建不同長(zhǎng)度的啟動(dòng)子缺失片段,最后利用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)分析該基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性及調(diào)控應(yīng)答激素的相關(guān)元件。結(jié)果顯示,保幼激素誘導(dǎo)沒有顯著改變BlVg啟動(dòng)子的活性,而20-羥基蛻皮酮對(duì)BlVg啟動(dòng)子活性具有明顯的誘導(dǎo)作用。4、轉(zhuǎn)錄因子Broad-Complex對(duì)BlVg啟動(dòng)子活性的調(diào)控作用運(yùn)用點(diǎn)突變技術(shù),發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子上DBrC3結(jié)合位點(diǎn)堿基的突變會(huì)導(dǎo)致其不能被20-羥基蛻皮酮誘導(dǎo);此外,將轉(zhuǎn)錄因子Broad-Complex與BlVg啟動(dòng)子共轉(zhuǎn)染至Sf9細(xì)胞,檢測(cè)啟動(dòng)子的熒光素酶活性,發(fā)現(xiàn)只有BlBrC-Z3轉(zhuǎn)錄因子可以提高啟動(dòng)子活性。
【圖文】：

蜂的生殖方式逡逑蜂的生殖方式包括兩性生殖和孤雌生殖。雖由受精卵發(fā)育而來的雌性蜂，但只有蜂王具有產(chǎn)受精卵和未受精卵；而工蜂的生殖系統(tǒng)發(fā)，只能產(chǎn)生未受精卵；雄蜂是由未受精卵發(fā)熊蜂蜂王產(chǎn)卵的因素逡逑然界的熊蜂蜂群繁育類似，在人工繁育中，蜂越冬或人工滯育的蜂王。因此，越冬蜂王的卵的發(fā)展起決定性作用。卵巢發(fā)育快的蜂王通常蜂出房也較早，因而，蜂群能夠快速擴(kuò)大。因蜂王產(chǎn)卵的因素達(dá)到理想的人工繁育規(guī)模。逡逑

有凝膠阻滯分析、ＤＮａｓｅｌ足跡實(shí)驗(yàn)和酵母單雜交分析。逡逑凝膠阻滯分析即電泳遷移率變動(dòng)分析（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ逡逑ＭｏｂｉｌｉｔｙＳｈｉｆｔＡｓｓａｙ，ＥＭＳＡ），其作用原理如圖１．２所示。具體原逡逑理如下：蛋白質(zhì)與末端標(biāo)記的核酸探針相結(jié)合可形成復(fù)合物，這逡逑種復(fù)合物在電泳時(shí)比無蛋白結(jié)合的探針泳動(dòng)的速度慢，即條帶位逡逑置相對(duì)滯后。該法操作簡(jiǎn)單、實(shí)驗(yàn)過程快速、反應(yīng)靈敏，，使其已逡逑成為研究啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄調(diào)控的一項(xiàng)重要方法。Ｋａｙｕｋａｗａ等利用該法逡逑證實(shí)家蠶保幼激素ＪＨ誘導(dǎo)的Ｋｒ－ｈｌ直接結(jié)合在Ｅ９３啟動(dòng)子上游的逡逑ＫＢＳ位點(diǎn)從而抑制Ｅ９３的轉(zhuǎn)錄［４７］0Ｚｈａｎｇ與Ｚｈｅｎｇ通過該法證明逡逑家蠶的幾丁質(zhì)酶５基因的啟動(dòng)子上含有ＢＲ－Ｃ邋Ｚ４順式調(diào)控元件逡逑［４８］。Ｎｉｓｈｉｔａ采用ＥＭＳＡ法發(fā)現(xiàn)ＥｃＲ／Ｕｓｐ可與ＢｍＢＲ－Ｃ啟動(dòng)子上逡逑的ＥｃＲＥ－Ｄｂ序列結(jié)合［４９］．逡逑白慰是取物逡逑二■取蛋白彶與ｓ敵結(jié)合逡逑／逡逑凝寂電泳邐逡逑Ｉ邐鼻——合物逡逑ｆ—Ｔ—逡逑放射自顯影逡逑：｜邐邐ｊ邐滯后逡逑１邐邐邋ｆ￣￣￣白結(jié)含逡逑ｉｉ—ｉｉｎｉ邐Ｉ逡逑圖１．２凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)原理圖逡逑Ｆｉｇ．１．２邋Ｔｈｅ邋ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆ邋ＥＭＳＡ逡逑ＤＮａｓｅｌ足跡實(shí)驗(yàn)，可用來檢測(cè)被特定的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的ＤＮＡ逡逑序列所在位置及其核苷酸序列結(jié)構(gòu)�；驹硎钱�(dāng)ＤＮＡ分子中的逡逑某一區(qū)段與特異的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合之后便可得到保護(hù)而免受ＤＮａｓｅｌ逡逑酶的切割作用，結(jié)果在凝膠電泳放射性自顯影圖片上便出現(xiàn)了一逡逑個(gè)空白區(qū)，俗稱為“足跡”。該方法不僅能找到與特異ＤＮＡ結(jié)合逡逑的目標(biāo)蛋白
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士后
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S891

【參考文獻(xiàn)】

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1 安建東;陳文鋒;;中國(guó)水果和蔬菜昆蟲授粉的經(jīng)濟(jì)價(jià)值評(píng)估[J];昆蟲學(xué)報(bào);2011年04期

2 徐志洲;梁翠榮;陳海;田md;高向東;;用于蛋白質(zhì)間相互作用研究的分析技術(shù)[J];藥學(xué)進(jìn)展;2010年04期

3 黃玉;楊波;遲小華;劉麗宏;李薇;盧學(xué)春;;真核生物啟動(dòng)子的研究及應(yīng)用[J];生物技術(shù)通訊;2010年02期

4 魏兆軍;洪桂云;姜紹通;魯成;;家蠶腦核蛋白抽提及其與PTTH基因啟動(dòng)子的凝膠阻滯分析[J];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué);2008年01期

5 黃家興;安建東;吳杰;國(guó)占寶;;熊蜂為溫室茄屬作物授粉的優(yōu)越性[J];中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào);2007年03期

6 劉煒彬;貢成良;薛仁宇;周文林;諸戌嫻;曹廣力;;家蠶絲蛋白Fhx/P25基因啟動(dòng)子區(qū)域的克隆及序列分析[J];動(dòng)物學(xué)研究;2007年01期

本文編號(hào)：2703107