【摘要】：豬胃蛋白酶是一種酸性水解酶,在飼料、食品、皮革、醫(yī)藥等方面有著廣泛應(yīng)用。本文將來源于豬的胃蛋白酶基因成功整合到畢赤酵母GS115基因組上,并在畢赤酵母中成功表達(dá)。在搖瓶水平下,通過發(fā)酵條件優(yōu)化,豬胃蛋白酶在BMGY-1培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng),在添加甲醇至終濃度為2.5%的BMMY-1培養(yǎng)基中誘導(dǎo)表達(dá),第9 d達(dá)到最大酶活2322 IU/mL。產(chǎn)豬胃蛋白酶畢赤酵母菌株10 L發(fā)酵罐擴大培養(yǎng),豬胃蛋白酶酶活最高達(dá)到11388 IU/mL,較搖瓶發(fā)酵酶活提高了 4.9倍。轉(zhuǎn)運核糖核酸(tRNA)是蛋白質(zhì)合成過程中重要參與成分之一,為了探索稀有密碼子對應(yīng)的tRNA(稀少tRNA)豐度改變對外源基因表達(dá)量的影響,本文構(gòu)建了畢赤酵母稀少tRNA基因與外源基因共表達(dá)體系。首先在GFP基因中添加由4個連續(xù)脯氨酸稀有密碼子CCG組成的阻遏區(qū),結(jié)果顯示該GFP基因的表達(dá)量明顯降低。然后將帶有阻遏區(qū)的GFP基因和tRNACCGPro基因順次連接于pPIC9K載體上,在畢赤酵母GS115中共表達(dá),結(jié)果使GFP表達(dá)量提高了 4.9%;另將帶有阻遏區(qū)的GFP基因和tRNACCGPro基因分別連接于pPIC9K和pFLDα載體,在畢赤酵母GS115中共表達(dá),GFP表達(dá)量最高提高了 12.5%;應(yīng)用同樣方式將tRNACCGPro基因與NFATc3T-GFP融合基因共表達(dá),其表達(dá)量提高了 21.3%。可見,tRNACCGPro在畢赤酵母GS115中確為稀少tRNA,通過共表達(dá)tRNACCGPro基因可顯著提高帶有連續(xù)該密碼子的外源基因表達(dá)量,并且,本文構(gòu)建的共表達(dá)體系將同樣適用于其他稀少tRNA基因的篩選和驗證。同時,驗證得到添加tRNA共表達(dá)在基本培養(yǎng)基中誘導(dǎo)表達(dá)比在豐富培養(yǎng)基中誘導(dǎo)表達(dá)優(yōu)勢更加明顯。
【圖文】：

圖２－１酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線逡逑Ｆｉｇ．邋２－１邋Ｓｔａｎｄａｒｄ邋ｃｕｒｖｅ邋ｏｆ邋Ｌ－ｔｙｒｏｓｉｎｅ邋ｃｏｎｔｅｎｔ逡逑．５．４待測酶液的制備逡逑各取１邋ｍＬ菌液（同批培養(yǎng)三組平行），１２０００邋ｒ／ｍｉｎ離心５邋ｍｉｎ，取合適體清液，用ｐＨ邋２．０乳酸－乳酸鈉緩沖液稀釋到一定濃度，使得測定的ＯＺ）２８Ｑ值位曲線之內(nèi)。逡逑．５．５胃蛋白酶酶活的測定逡逑１）先將酪蛋白溶液放入測定溫度４０°Ｃ的水浴鍋中，預(yù)熱５邋ｍｉｎ；逡逑２）操作步驟如下：逡逑離心管Ａ邋（對照組）邐離心管Ｂ邋（實驗組）逡逑Ｉ邐Ｉ逡逑Ｖ邐Ｖ逡逑加酶液２５０邋［ｉＬ邐加酶液２５０邋ｆｉＬ逡逑N測定溫度水�。玻恚椋钸奛測定溫度水浴２邋ｍｉｎ逡逑Ｖ邐Ｖ逡逑力口０＿４１１１0１／１：１：０八５００（１］：（搖勻）邋加酪蛋白２５０邋ｐＬ邋（搖勻）逡逑１邐１逡逑

２邋忖料與方；＇ｊ，邐逡逑為了給待驗證的伙基因提供對照，構(gòu)建了包含不能識別密碼子ＣＣＧ的逡逑皂的基因的載體ｐＦＬＤｃｃ－ｔＲＮＡ巧Ａ邋（簡寫ｐｔＲＮＡ二Ａ）。逡逑表２－５實驗用引物逡逑Ｔａｂｌｅ邋２－５邋Ｔｈｅ邋ＰＣＲ邋ｐｒｉｍｅｒｓ邋ｕｓｅｄ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ逡逑ｙ邋ＰＣＲ邐Ｐｒｉｍｅｒ邋ｓｅｑｕｅｎｃｅ（５’－３’）逡逑ＴＡＣＧＴＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧＴＣＧＡＡＡＧＧＧＧＡＡＣＣＧＣ逡逑ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＴＴＴＧＴＡＣＡＡＴＴ逡逑ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＴＣＧＡＡＡＧＧＧＧＡＡＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＧＡＡＴＴＡＴＴＣＡＣＴ逡逑ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＣＧＡＡＴＣＴＧＡＴＴＴＣＴＴＡＧＡＡＡＡＡＡＴＴＧＡＡＣＴＣＧＧＧ逡逑ＣＧＣＧＧＡＴＧＣＡＣＡＡＡＡＣＡＡＴＡＧＡＡＴＣＡＡＧＡ逡逑ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＡＧＧＡＧＧＧＣＡＴＴＡＧＣ逡逑ＣＧＣＧＧＡＴＧＣＡＴＡＡＡＡＧＣＡＴＴＧＡＧＣＡＣＧ逡逑ＣＧＣＧＧＡＴＧＣＡＴＣＴＡＴＴＧＧＡＡＡＡＧＴＧＡＣＧＡＴ逡逑ｙ邐ＡＴＧＴＣＧＡ．ＡＡＧＧＧＧＡＡ邋ＧＡＡ邋—、（；ＦＰ４ＣＣ（；逡逑
【學(xué)位授予單位】：天津科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：Q78

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本文編號：2701146