【摘要】：第一部分Laron綜合征患者臨床特點總結(jié)目的:總結(jié)Laron綜合征患者的臨床特點及基因檢測結(jié)果,并比較不同種族Laron綜合征患者的臨床特點。研究對象和方法:1.收集臨床資料:收集2012年至2017年就診于我院內(nèi)分泌科的Laron綜合征患者的臨床資料及血清學檢查結(jié)果,包括血常規(guī)、肝腎功、甲狀腺功能、血清GH和IGF-1水平。每個患者分別進行2項生長激素激發(fā)實驗,分別于用藥前及用藥后30分鐘、60分鐘、90分鐘、120分鐘采集外周血清測定GH濃度。影像學檢查包括鞍區(qū)核磁及左手腕關(guān)節(jié)骨齡相。2.采集外周全血進行GHR基因外顯子測序:簽署知情同意書后,采集患者及家屬外周全血標本,提取外周血白細胞DNA,設(shè)計引物擴增GHR基因,測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中比對,運用軟件對新發(fā)突變進行功能預測。3.系統(tǒng)綜述:在Pubmed、萬方、知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫中分別運用英文和中文關(guān)鍵詞“Laron syndrome”,、“growth hormone insensitivity”,、“Laron-type dwarfism”.“growth hormone resistance syndrome”、“Laron綜合征”、“生長激素不敏感綜合征”、“Laron型侏儒”、“生長激素抵抗”檢索文獻,正文內(nèi)對每個患者的臨床資料都有描述的文獻予以納入。結(jié)果:1.臨床資料:共納入4例Laron綜合征患者,均為男性,平均起病年齡為2.5歲(1.0歲-6.0歲),平均診斷年齡為7.6歲(3.5歲-14.3歲),在起病平均5.1年后,獲得明確診斷�；颊呱砀逽DS中位數(shù)為-4.73(-6.71～-2.80),體重SDS中位數(shù)為-2.58(-2.96～-1.82),身高落后較體重落后更為顯著�；颊�4具有Laron綜合征的典型面容(前額突出、鼻梁塌陷、中面部發(fā)育不良),其余3例患者面容無明顯異常。4例Laron綜合征患者GH基礎(chǔ)值分別為15.44ng/ml、2.1Ong/ml、9.60ng/ml和1.59ng/ml(正常范圍:2.0Ong/ml),GH激發(fā)實驗后峰值分別為23.36ng/ml、31.70ng/ml和33.80ng/ml,患者2未行GH激發(fā)試驗�；颊�1血清IGF-1濃度為32ng/ml,其余3例均低于檢測范圍下限(25ng/ml)。所有患者均存在骨齡延遲,分別較實際年齡落后12個月、6個月、28個月和24個月,患者骨齡較實際年齡平均延遲17.5個月。4例患者中患者1和患者4接受過rhGH治療,患者1治療劑量為0.053 mg/kg/d,共治療2月,治療后身高增加3.30cm�；颊�4治療劑量為0.057mg/kg/d,共治療10月,治療后血清IGF-1水平仍然小于25ng/ml,治療后身高增加5.75cm。2.GHR基因外顯子測序:4例患者中共發(fā)現(xiàn)5種SNP位點,分別為c.1483CA(p.P495T)和c.1630AC(p.I544L)(患者 1);c.558AG(p.G186G)、c.1319GT(p.C440F)和c.1735(p.P579T)(患者2)。1個基因突變位點既往有過報道,此位點為c.587AC(p.Y196S)(患者4)。此外,患者2-4各發(fā)現(xiàn)1個新的突變位點,分別為c.808AG(p.I270V)(患者 2)、c.766CT(p.Q256X)(患者 3)和c.1707-171 Ode1(p.E570fs)(患者4)。軟件功能預測結(jié)果提示p.I270V為良性變異,p.Q256X和p.E570fs為致病性突變。3.中國Laron綜合征患者臨床特點:文獻報道中國Laron綜合征患者共計35名(含本研究4例),男女比例為27:8(3.4:1),平均年齡為9.1±3.4歲(2.2歲-15.0歲),中位身高SDS為-4.40(Q1,Q3:-5.90,-2.67)。生長激素激發(fā)實驗后中位GH峰值為 17.01 ng/ml(Q1,Q3:14.56,33.20)。IGF-1 SDS平均值為-2.65±0.55(N=23),IGFBP-3 SDS平均值為-1.82±1.16(N=17)。共有13名患者具有GHR基因突變,共計10種突變類型,不同突變類型的患者之間身高無明顯差異。3名患者發(fā)現(xiàn)IGFALS基因突變,身高缺陷較輕,身高SDS中位數(shù)為-2.66。4.不同種族之間Laron綜合征患者臨床特點的比較:比較13名土耳其患者、9名印度患者、35名歐洲患者和35名中國患者的臨床特點,結(jié)果發(fā)現(xiàn)中國患者的診斷年齡明顯晚于歐洲患者,中位診斷年齡中國患者為9.0歲,歐洲患者為5.7歲(P=0.004)。土耳其患者身高缺陷較中國患者更為嚴重,二者身高SDS分別為-7.4和-4.4(P=0.001)。土耳其患者生長激素激發(fā)試驗后GH峰值明顯高于歐洲和中國患者(P值分別為0.003和0.000)。結(jié)論:1.Laron綜合征是一類罕見的導致矮小的遺傳性疾病,本研究收集的4例患者,3例發(fā)現(xiàn)有GHR基因的新突變位點�；颊吲R床表現(xiàn)異質(zhì)性較大,GH基礎(chǔ)值和GH激發(fā)試驗GH峰值都增高,但是IGF-1均較低。部分患者對rhGH治療有一定反應(yīng)性。隨著測序技術(shù)的不斷發(fā)展,越來越多的患者可以獲得明確的遺傳學診斷。2.在土耳其、印度、歐洲和中國患者中,中國患者診斷年齡最晚,土耳其患者身材矮小最嚴重,GH激發(fā)實驗后GH峰值最高。第二部分GHR基因突變的細胞學功能研究目的:對臨床發(fā)現(xiàn)的GHR基因新發(fā)突變位點進行細胞學水平的功能研究。方法:構(gòu)建表達GHR基因的野生型及3種突變型的質(zhì)粒載體(pcDNA3.1-GHR-WT、pcDNA3.1-GHR-Y196S、pcDNA3.1-GHR-Q256X、pcDNA3.1-GHR-E570fs)。采用陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑,將野生型和突變型GHR質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染進人胚腎HEK293T細胞及人肝癌HepG2細胞。48小時后,采用蛋白免疫印跡法(Westernblot,WB),檢測細胞內(nèi)GHR蛋白的表達情況。采用免疫熒光染色法,熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染后細胞內(nèi)GHR蛋白的分布情況。100ng/ml rhGH作用于轉(zhuǎn)染野生型及3種突變型GHR表達質(zhì)粒的HepG2細胞30分鐘后,采用WB方法,檢測細胞內(nèi)磷酸化STAT5蛋白的表達情況。l00ng/ml rhGH作用于轉(zhuǎn)染野生型及3種突變型GHR表達質(zhì)粒的HepG2細胞24小時后,采用實時熒光定量RT-PCR(qRT-PCR)法,檢測細胞內(nèi)IGF1基因mRNA水平的相對表達量;同時留取細胞培養(yǎng)液,用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA),檢測細胞培養(yǎng)液中IGF-1蛋白的濃度。結(jié)果:1.轉(zhuǎn)染后細胞內(nèi)GHR蛋白的表達量:分別轉(zhuǎn)染野生型及3種突變型GHR表達質(zhì)粒于HEK293T細胞和HepG2細胞后,采用抗HA標簽的抗體進行WB檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn),野生型GHR和Y196S突變型GHR蛋白,均在分子量為130kDa處有一明顯的條帶,但是野生型GHR蛋白表達量較Y196S突變型GHR蛋白的表達量高28.9%,差異具有顯著性(P0.05)。Q256X突變型由于產(chǎn)生截短蛋白,因此在分子量為43kDa處出現(xiàn)特異性條帶,而且其表達量較野生型GHR蛋白減少47.0%(P0.05)。E570fs突變是4個堿基缺失導致的移碼突變,在上述130kDa、43kDa以及其它低分子量處,均未檢測到特異性條帶。采用抗GHR的特異性抗體進行WB檢測,也獲得了相似的結(jié)果。2. GHR蛋白免疫熒光染色:轉(zhuǎn)染野生型和3種不同突變型GHR表達質(zhì)粒48小時后,固定細胞,采用抗HA標簽抗體進行免疫熒光染色,熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),在HEK293T細胞和HepG2細胞中,野生型GHR蛋白在細胞膜表面均勻分布,Y196S突變型GHR蛋白在細胞內(nèi)的分布模式與野生型類似,均勻分布在細胞膜上;Q256X和E570fs突變型GHR蛋白與野生型GHR蛋白分布模式不同,突變型GHR蛋白在細胞漿內(nèi)圍繞細胞核呈“戒指狀”分布,在胞漿內(nèi)細胞核一側(cè)有局限性的綠色熒光濃聚。3.轉(zhuǎn)染后HepG2細胞中磷酸化STAT5的表達量:在轉(zhuǎn)染野生型和3種突變型GHR表達質(zhì)粒的HepG2細胞培養(yǎng)液中,加入lOOng/mlrhGH作用30分鐘后,采用抗磷酸化的STAT5抗體進行WB檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與轉(zhuǎn)染野生型質(zhì)粒的HepG2細胞相比,轉(zhuǎn)染Y196S、Q256X和E570fs突變型GHR質(zhì)粒的HepG2細胞中,磷酸化STAT5的表達量顯著下降,分別降低了32.7%、40.6%和29.6%(P0.05)。4. rhGH作用后HepG2中IGF1基因mRNA的表達量:轉(zhuǎn)染野生型和3種突變型質(zhì)粒的HepG2細胞,加入100ng/ml rhGH作用24小時后,采用qRT-PCR法檢測IGFlmRNA的表達量,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與轉(zhuǎn)染野生型GHR質(zhì)粒的HepG2細胞相比轉(zhuǎn)染Y196S和Q256X突變型GHR質(zhì)粒細胞的IGFlmRNA表達量無明顯減少,但是轉(zhuǎn)染E570fs突變型GHR質(zhì)粒的細胞,IGF1 mRNA表達量卻較野生型明顯增高,增氋了64.1%(PC0.05)。5. rhGH作用后HepG2細胞培養(yǎng)液中IGF-1蛋白的濃度:在轉(zhuǎn)染野生型和3種突變型質(zhì)粒的HepG2細胞培養(yǎng)液中加入lOOng/mlrhGH,作用24小時后,采用ELISA檢測細胞培養(yǎng)液中IGF-1的水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染野生型GHR質(zhì)粒的細胞培養(yǎng)中,IGF的濃度為71.88 pg/ml,轉(zhuǎn)染3種突變型GHR質(zhì)粒的IGF-1濃度分別為94.80pg/ml,95.63 pg/ml和95.63 pg/ml,各組之間IGF-1蛋白濃度無顯著差異(P=0.238)。結(jié)論:1.Y196S突變型GHR蛋白表達量較野生型GHR明顯降低,其在細胞中的分布和野生型沒有明顯差異,但是其激活GH受體后信號通路上STAT5的能力減低。2.Q256X突變后產(chǎn)生分子量約43kDa的截短蛋白,其表達量明顯低于野生型GHR,Q256X突變型蛋白滯留于細胞質(zhì)中,對STAT5信號分子的激活能力明顯減弱。3.E570fs突變型GHR蛋白分子量大小未知,其蛋白滯留于細胞質(zhì)中,對STAT5信號分子的激活能力減弱。
【圖文】：

一，ｃ．８０８Ａ＞Ｇｐ．Ｉ７０Ｖ、ｃ．７６６Ｃ＞Ｔｐ．Ｑ５６Ｘ．邋１７０７－１７１邋Ｏｄｅｌ邋（ｐ．Ｅ５７０ｆｓ）。逡逑患者１檢測出ＧＨＲ基因的復合雜合變異，均位于第１０外顯子上（Ｐ４９５Ｔ５４４Ｌ，圖邋１－１）0逡逑Ａ＊邋■？？＊？？？？邋？邐．邋．邋Ｖ邋？邋？邋？邋■邋？邋■邋Ｑ邋＇邐！邐＊邐！邐？邐：邐？邐！邐！邋ｆ邋！逡逑１邐５：逡逑

患者４含有兩個復合雜合突變位點，分別為Ｙ１９６Ｓ和Ｅ５７０ｆｓ，，其中Ｙ１９６Ｓ突逡逑變來自于母親，是一個錯義突變；Ｅ５７０ｆｓ突變來自于父親，由于連續(xù)缺失了邋４個堿逡逑基，造成密碼子的閱讀框發(fā)生改變（圖１－５）。逡逑Ａ＊邐？邐？邐■邐．邐Ｄ邋＇邐■？？？＊－－邐逡逑３邋ｉ邋Ｓ邋３邋Ｓ邋３邐３邐：邋Ｓ逡逑ｔ逡逑Ｊｈ邋Ｉ邋ｉ邋｜｜邋＾邐—逡逑Ｅｘｏｎ邋６邋ｃ．５８７Ａ＞邋Ｃ邐Ｅｘｏｎ邋１０邋ｃ．１７０７－１７１邋Ｏｄｅｌ逡逑ｃ邋１邋□￣￣ｒ－0逡逑ｎ邋ｒ逡逑圖１－５患者４基因檢測結(jié)果（Ａ、Ｂ）和家系圖（Ｃ）。逡逑注：男性致病基因攜帶者，Ｑ女性致病基因攜帶者，先證者逡逑分別用在線軟件對上述新發(fā)現(xiàn)的突變位點進行功能預測，以初步判斷突變是否逡逑會影響基因的功能。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ＳＩＦＴ、ＰｏｌｙＰｈｅｎ－２和Ｍｕｔａｔｉｏｎ邋Ｔａｓｔｅｒ軟件預測Ｉ２７０Ｖ逡逑突變?yōu)榱夹宰儺�；Ｍｕｔａｔｉｏｎ邋Ｔａｓｔｅｒ預測Ｑ２５６Ｘ和Ｅ５７０ｆｓ突變均為致病突變（表１－６）。逡逑２２逡逑
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R725.8

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8 周

本文編號：2695008