【摘要】：氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AAPs基因在擬南芥中被首次發(fā)現(xiàn),經(jīng)大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明擬南芥中AAPs基因?qū)χ仓牦w內(nèi)氨基酸的種類和數(shù)量起到調(diào)控作用。越來越多的科學(xué)家證明了AAPs基因主動參與一些植物體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收及代謝產(chǎn)物的轉(zhuǎn)運(yùn)。但在玉米中關(guān)于AAP基因的研究鮮見報(bào)道,因此,本研究旨在從玉米中克隆出AAP基因并探究其功能,從而明確玉米中AAP基因的表達(dá)與氨基酸吸收的關(guān)系,為玉米吸收氨基酸分子機(jī)制的研究提供理論基礎(chǔ),并為今后創(chuàng)造氨基酸吸收含量高的新玉米材料提供理論依據(jù)和候選基因。本研究克隆了玉米ZmAAP基因,并通過本底表達(dá)和真核表達(dá)對該基因的功能進(jìn)行了初步分析,主要結(jié)果如下:1.采用同源克隆技術(shù)得到玉米中一段未知功能基因片段1396bp。運(yùn)用生物信息學(xué)對該基因序列進(jìn)行分析,采用RT-PCR技術(shù)克隆得到該玉米未知功能基因片段1396bp。運(yùn)用生物信息學(xué)對該序列進(jìn)行分析,可知該未知功能基因編碼區(qū)核苷酸序列與大麥AAP1基因的相似性最高,相似度為87%,初步證明從玉米中克隆的基因可能為AAP基因的核酸序列,命名為ZmAAP。ZmAAP基因全長cDNA序列包括1212bp的開放閱讀框,ZmAAP基因編碼的氨基酸序列氨基酸數(shù)403個(gè),相對分子質(zhì)量42.88KDa,理論等電點(diǎn)9.24,正、負(fù)電荷殘基總數(shù)分別是18和30,在組成ZmAAP蛋白編碼的20種氨基酸中絲氨酸所占比例最高,達(dá)到13.4%,而組氨酸所占比例最低,僅為1.0%,總平均親水性為0.220。ZmAAP蛋白包含信號肽,剪切位點(diǎn)位于38,39殘基處;有5個(gè)跨膜區(qū)。2.通過熒光定量PCR測定不同生育期(出苗期、拔節(jié)期、大喇叭口期、抽雄期、吐絲期、乳熟期、完熟期)玉米植株和不同成熟度(10天、20天、30天、40天、50天、60天)玉米種子中ZmAAP基因的組織表達(dá)情況。同時(shí)測定了不同生育期玉米植株和不同成熟度種子中總游離氨基酸含量、可溶性蛋白含量、20種氨基酸組分這三個(gè)生理生化指標(biāo),發(fā)現(xiàn)在玉米根、葉、種子中總游離氨基酸含量與ZmAAP基因表達(dá)量的變化趨勢相一致。在玉米葉、種子中可溶性蛋白含量與ZmAAP基因表達(dá)量的變化趨勢相一致。ZmAAP基因在玉米根、葉、種子中表達(dá)量最高的時(shí)期相應(yīng)部位堿性氨基酸含量均增速加快。后經(jīng)生理生化指標(biāo)與ZmAAP基因表達(dá)量之間的相關(guān)性分析表明玉米根、葉、種子中ZmAAP基因的表達(dá)量與總游離氨基酸含量呈顯著正相關(guān)性,玉米葉和種子中ZmAAP基因的表達(dá)量與可溶性蛋白含量呈顯著正相關(guān)性,因此初步確定ZmAAP基因的表達(dá)能夠影響氨基酸和蛋白質(zhì)的含量。3.通過構(gòu)建植物表達(dá)載體pCAMBIA3301-ZmAAP后經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將ZmAAP基因?qū)霐M南芥,再經(jīng)除草劑篩選從而獲得轉(zhuǎn)ZmAAP基因擬南芥,獲得T2代轉(zhuǎn)基因擬南芥25株。以T2代轉(zhuǎn)基因型擬南芥為實(shí)驗(yàn)材料,在擬南芥不同生育期對其進(jìn)行表型分析,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因型擬南芥的根系長度,側(cè)根的數(shù)量,葉片表面積,分枝莖數(shù)量明顯高于野生型擬南芥。4.通過測定轉(zhuǎn)基因型和野生型擬南芥中總游離氨基酸含量和可溶性蛋白含量,明確轉(zhuǎn)基因型擬南芥中總游離氨基酸含量和可溶性蛋白質(zhì)含量明顯高于野生型擬南芥,符合表型分析結(jié)果。通過測定不同生育期(出苗期,抽薹期,開花期)轉(zhuǎn)基因型擬南芥植株ZmAAP基因的組織表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)ZmAAP基因在葉片中的表達(dá)量最高。將ZmAAP基因的表達(dá)量與總游離氨基酸含量和可溶性蛋白質(zhì)含量進(jìn)行了相關(guān)性分析,結(jié)果表明ZmAAP基因表達(dá)量的變化與總游離氨基酸含量呈現(xiàn)顯著正相關(guān)性。因此,明確ZmAAP基因在擬南芥中的表達(dá)能夠提高擬南芥中氨基酸的含量。
【圖文】：

AAP 基因全長 cDNA 的克隆段的擴(kuò)增：根據(jù) NCBI 中發(fā)布的擬南芥和大麥中 AAP1 基因的氨基設(shè)計(jì) 1 對簡并引物 A1、A2，以玉米葉片總 RNA 為模板，以 Oligd cDNA，利用簡并引物進(jìn)行 RT-PCR 反應(yīng)，擴(kuò)增出 355bp 的片段（因部分序列測序結(jié)果與擬南芥、大麥 AAP 基因比對結(jié)果如圖 2-3 所P 基因全長 cDNA 的克�。和ㄟ^中間片段的堿基序列在 NCBI 中 B能的玉米基因片段，以合成的玉米 cDNA 為模板，B1、B2 為引物，經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠電泳，在 1400bp 處出現(xiàn)特異性片段，大小與預(yù)測收，連接，轉(zhuǎn)化，后對其進(jìn)行質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證（圖 2-5）。測序結(jié)因測序序列與玉米基因組未知功能基因的相似性達(dá)到 99.67%（圖得到玉米 AAP 基因片段 1396bp。M.DL2000Marker1.為總RNAM.DL2000Marker1.TotalRNA圖2-1玉米總RNA的電泳圖1ElectrophoresisoftotalRNAfrommaizeM.DL2000 Marker 1.PCR 產(chǎn)物M.DL2000 Marker 1.PCR produc圖 2-2 玉米AAP基因的部分序列電泳Fig.2-2 Partial sequence electrophoresis results of

2.3.1.2 玉米 AAP 基因全長 cDNA 的克隆中間片段的擴(kuò)增：根據(jù) NCBI 中發(fā)布的擬南芥和大麥中 AAP1 基因的氨基酸序列，在基因保守區(qū)設(shè)計(jì) 1 對簡并引物 A1、A2，以玉米葉片總 RNA 為模板，，以 OligdT 為反轉(zhuǎn)錄引物，合成 cDNA，利用簡并引物進(jìn)行 RT-PCR 反應(yīng)，擴(kuò)增出 355bp 的片段（圖 2-2）。玉米 AAP 基因部分序列測序結(jié)果與擬南芥、大麥 AAP 基因比對結(jié)果如圖 2-3 所示。玉米 AAP 基因全長 cDNA 的克隆：通過中間片段的堿基序列在 NCBI 中 BLAST 得到一段未知功能的玉米基因片段，以合成的玉米 cDNA 為模板，B1、B2 為引物，在進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。產(chǎn)物經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠電泳，在 1400bp 處出現(xiàn)特異性片段，大小與預(yù)測值相符（圖2-4）。經(jīng)回收，連接，轉(zhuǎn)化，后對其進(jìn)行質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證（圖 2-5）。測序結(jié)果顯示玉米全長 AAP 基因測序序列與玉米基因組未知功能基因的相似性達(dá)到 99.67%（圖 2-6），表明成功分離得到玉米 AAP 基因片段 1396bp。M.DL2000Marker1.TotalRNA圖2-1玉米總RNA的電泳圖Fig.2-1ElectrophoresisoftotalRNAfrommaizeM.DL2000 Marker 1.PCR products圖 2-2 玉米AAP基因的部分序列電泳結(jié)果Fig.2-2 Partial sequence electrophoresis results of maize AAP
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S513

【參考文獻(xiàn)】

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