【摘要】：為探討絲氨酸蛋白酶編碼基因prtP對(duì)副干酪乳桿菌黏附特性的影響,利用λRed重組系統(tǒng)敲除副干酪乳桿菌的prtP基因,構(gòu)建副干酪乳桿菌prtP基因缺失突變株,比較突變株與親本株的表面結(jié)構(gòu)、黏附特性的差異。結(jié)果表明,prtP基因缺失突變株的生長(zhǎng)速度變慢,疏水性和自聚合性明顯下降,抑菌效果無(wú)顯著性差異,對(duì)抗生素的敏感性發(fā)生了顯著變化,體外對(duì)細(xì)胞的黏附性顯著降低。可見(jiàn),prtP基因?qū)Ω备衫胰闂U菌的黏附特性十分重要,該基因缺失將改變菌株的生物學(xué)特性。
【圖文】：

Ｓ?7℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育48h。待細(xì)胞完全貼壁，以無(wú)菌PBS洗滌2次，每孔加入1ml濃度為1×108CFU/ml的乳酸菌懸液，孵育1～2h。以鏡檢法和涂布平板法評(píng)價(jià)副干酪乳桿菌親本株及其prtP基因缺失突變株L．p△prtP對(duì)3種細(xì)胞的黏附性。2結(jié)果與分析2．1突變株L．pΔprtP的鑒定根據(jù)GenBank公布的副干酪乳桿菌的基因序列，分析啟動(dòng)子和開(kāi)放性閱讀框，結(jié)果顯示基因prtP擁有獨(dú)立的單個(gè)開(kāi)放閱讀框，含有7820個(gè)堿基對(duì)。插入氯霉素突變后，以突變副干酪乳桿菌為模板，用引物PS/PA進(jìn)行PCＲ鑒定，得到1175bp的片段(圖1)，與預(yù)期結(jié)果一致，證實(shí)得到的菌株為副干酪乳桿菌突變株。圖1副干酪乳桿菌突變株(L．p△prtP)的prtP基因片段PCＲ擴(kuò)增Fig．1PCＲamplificationofprtPgenefragmentinthemutantstrainofLactobacillusparacasei(L．pΔprtP)2．2副干酪乳桿菌prtP基因缺失突變株與親本株的表面結(jié)構(gòu)差異在透射電鏡下，副干酪乳桿菌prtP基因缺失突變株(L．pΔprtP)與其親本株的表面結(jié)構(gòu)無(wú)明顯差異，細(xì)胞表面的黑斑狀陰影可能是被吸附到表面的雜質(zhì)(圖2)。劉昭等:絲氨酸蛋白酶編碼基因prtP對(duì)副干酪乳桿菌黏附特性的影響685

A:副干酪乳桿菌親本株;B:副干酪乳桿菌突變株。圖2副干酪乳桿菌親本株及其突變株(L．pΔprtP)電鏡圖Fig．2ElectronmicroscopicimagesofL．paracaseiparentalstrainandL．paracaseimutantstrain(L．pΔprtP)2．3副干酪乳桿菌prtP基因缺失突變株的生長(zhǎng)曲線副干酪乳桿菌prtP基因缺失突變株的生長(zhǎng)曲線與其親本株類(lèi)似，都經(jīng)歷了適應(yīng)期、對(duì)數(shù)期和平臺(tái)期，但突變株的生長(zhǎng)速度明顯慢于親本株(圖3)。在MＲS培養(yǎng)基中，從第4h開(kāi)始兩菌株的生長(zhǎng)速度出現(xiàn)差異，親本株在第11h時(shí)生長(zhǎng)速度接近穩(wěn)定，而突變株此時(shí)仍在對(duì)數(shù)期，直到第16h時(shí)才開(kāi)始穩(wěn)定。圖3副干酪乳桿菌親本株和突變株的生長(zhǎng)曲線Fig．3ThegrowthcurveforL．paracaseiparentalstrainandmutantstrain2．4副干酪乳桿菌prtP基因缺失突變株的表面疏水性由圖4可以看出，副干酪乳桿菌prtP基因缺失突變株與親本株的表面疏水性差異很大，親本株的疏水性達(dá)到85.5%，而突變株僅為35.6%，差異顯著(P＜0.01)。在試管中副干酪乳桿菌親本株菌液澄清透明，突變株菌液明顯渾濁。2．5副干酪乳桿菌prtP基因缺失突變株的自聚合能力副干酪乳桿菌突變株與親本株的自聚合能力差＊＊表示差異極顯著(P＜0．01)。圖4副干酪乳桿菌親本株和突變株的表面疏水性Fig．4ThesurfacehydrophobicpropertyofL．paracaseipa-rentalstrainandmutantstrain異極顯著(P＜0.01)，分別為16.9%、33.1%(圖5)。在MＲS培養(yǎng)基中，副干酪乳桿菌親本株聚集明顯，，而突變株菌液比較清澈，聚集較少。＊＊表示差異極顯著(P＜0．01)。圖5副干酪乳桿菌親本株和突變株的自聚合能力Fig．5TheautoaggregationofL．paracaseiparentalstrainandmutantstrain2．6副干酪乳桿菌prtP基因缺失突變株的抑菌能力采用打孔法測(cè)定副干

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